一种与辣椒抗PMMoV紧密连锁的分子标记及其应用
本发明涉及生物中，一种与辣椒抗pmmov紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术：
1、辣椒(capsicum annuuml.)为茄科辣椒属草本植物。据联合国粮食及农业组织(food and agriculture organization，fao；https://www.fao.org/home/zh)报道，2022年中国辣椒、甜椒的栽培面积约为7.60×105ha，约占全球栽培总面积的27.33％，是全球辣椒、甜椒种植面积最大的国家；鲜食辣椒总产量约为1.68×107t，约占全球总产量的31.29％，是全球产量最大的国家。
2、辣椒生产中检测多种病毒，有烟草花叶病毒(tmv)、辣椒轻斑驳病毒(pmmov)、黄瓜花叶病毒(cmv)、马铃薯y病毒(pvy)、番茄斑萎病毒(tswv)、番茄斑驳花叶病毒(tommv)、蚕豆萎蔫病毒(bbwv)、烟草蚀纹病毒(tev)等33种病毒，且存在多种病毒复合感染的情况。近年来在中国16个省(市、自治区)的辣椒病毒病检测中，检出率最高的前五种病毒为pmmov、cmv、bbwv、tev、tswv，检出率分别为24.76％、19.05％、12.38％、12.38％和10.48％。虽然，在采用物理方法、化学方法、严格的生产栽培管理等措施后，能够起到一定的防治效果，但并不能完全杜绝pmmov的发生，且防治成本较高，而选育抗pmmov辣椒品种是最行之有效的途径。
3、到目前为止，人们虽然对辣椒抗pmmov基因即l3进行精细定位，开发了共分离标记。同时，通过辣椒对tmv抗性基因l4基因进行了定位，开发了紧密连锁标记。但在实际的辅助选择育种工作中发现，此区间的基因存在紧密连锁且发生交换不平衡的情况。辣椒抗病性育种通常需要不断采用人工接种鉴定的方法筛选抗病亲本，育成高代自交系。此过程复杂繁琐，且容易造成种子传毒。通过构建定位群体，对抗pmmov基因进行定位，开发与抗pmmov紧密连锁的分子标记，可以在育种工作中提高辣椒抗pmmov分子辅助选择育种的效率，缩短育种周期，有助于培育抗pmmov辣椒新品种。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是如何检测辣椒pmmov抗病性。
2、为解决上述技术问题，本发明首先提供了辣椒pmmov抗病性分子标记或检测所述辣椒pmmov抗病性分子标记的物质在检测或辅助检测辣椒pmmov抗病性中的应用；
3、所述辣椒pmmov抗病性分子标记为辣椒基因组中对应于序列表中seq id no.1的第53-65位的核苷酸，其为ttttttttttttt或tttttttttt。
4、上述应用中，所述检测所述辣椒pmmov抗病性分子标记的物质可包括：能扩增含有序列表中seq id no.1的第53-65位的dna片段的引物对。
5、具体的，所述引物对可由序列表中seq id no.3和4所示的两条单链dna组成。
6、所述检测所述辣椒pmmov抗病性分子标记的物质可仅由所述引物对组成。
7、本发明还提供了检测辣椒pmmov抗病性的方法，所述方法包括：检测待测辣椒的基因组dna中对应于序列表中seq id no.1的第53-65位的核苷酸，基因组dna中对应于序列表中seq id no.1的第53-65位的核苷酸为ttttttttttttt的纯合待测辣椒pmmov抗病或候选pmmov抗病，基因组dna中对应于序列表中seq id no.1的第53-65位的核苷酸为ttttttttttttt与tttttttttt的杂合待测辣椒pmmov抗病或候选pmmov抗病，基因组dna中对应于序列表中seq id no.1的第53-65位的核苷酸为tttttttttt的纯合待测辣椒pmmov感病或候选pmmov感病。
8、本发明还提供了另一种检测辣椒pmmov抗病性的方法，所述方法包括：以待测辣椒的基因组dna为模板，利用所述引物对进行pcr扩增，得到pcr产物；检测所得扩增产物的大小，扩增产物含有112bp的dna片段且不含109bp的dna片段的待测辣椒pmmov抗病或候选pmmov抗病；扩增产物含有112bp与109bp的两条dna片段的待测辣椒pmmov抗病或候选pmmov抗病；扩增产物含有109bp的dna片段且不含112bp的dna片段的待测辣椒pmmov感病或候选pmmov感病。
9、本发明还提供了第三种检测辣椒pmmov抗病性的方法，所述方法包括：以待测辣椒的基因组dna为模板，利用所述引物对进行pcr扩增，得到pcr产物；检测所得扩增产物的序列，扩增产物含有seq id no.1所示dna片段且不含seq id no.2所示dna片段的待测辣椒pmmov抗病或候选pmmov抗病；扩增产物含有seq id no.1与seq id no.2所示的两条dna片段的待测辣椒pmmov抗病或候选pmmov抗病；扩增产物含有seq id no.2所示dna片段且不含seq id no.1所示dna片段的待测辣椒pmmov感病或候选pmmov感病。
10、上述方法中，利用所述引物对进行pcr扩增的体系可为：基因组dna1μl，mix(2×3gtaq master mix for page，vazyme)5μl，ddh2o 3μl，两条引物各0.5μl(在反应体系中的浓度均为10μm)。
11、上述方法中，利用所述引物对进行pcr扩增的条件可为：95℃预变性5min，95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环，最后72℃延伸5min。
12、上述方法中，检测所述扩增产物的大小可通过电泳检测，也可通过测序等其他方法检测，只要能检测到扩增产物各dna片段的大小即可。检测所述扩增产物的序列可通过测序进行。
13、所述检测所述辣椒pmmov抗病性分子标记的物质，也属于本发明的保护范围。
14、所述检测所述辣椒pmmov抗病性分子标记的物质在制备检测或辅助检测辣椒pmmov抗病性产品中的应用，也属于本发明的保护范围。
15、所述检测所述辣椒pmmov抗病性分子标记的物质在辣椒育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
16、所述辣椒pmmov抗病性分子标记在辣椒育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
17、实验证明，在456株的辣椒f2群体中，基因组dna中对应于序列表中seq id no.1的第53-65位的核苷酸为ttttttttttttt的纯合单株基本抗pmmov，基因组dna中对应于序列表中seq id no.1的第53-65位的核苷酸为ttttttttttttt与tttttttttt的杂合单株基本抗pmmov，基因组dna中对应于序列表中seq id no.1的第53-65位的核苷酸为tttttttttt的纯合单株基本感pmmov，利用本发明的辣椒pmmov抗病性分子标记鉴定辣椒pmmov抗病性的准确性为98.2％。表明，本发明的辣椒pmmov抗病性分子标记可用于鉴定辣椒pmmov抗病性，用于辣椒的杂交育种。
18、下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
技术特征：
1.辣椒pmmov抗病性分子标记或检测所述辣椒pmmov抗病性分子标记的物质在检测或辅助检测辣椒pmmov抗病性中的应用；
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测所述辣椒pmmov抗病性分子标记的物质包括：能扩增含有序列表中seq id no.1的第53-65位的dna片段的引物对。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述引物对由序列表中seq id no.3和4所示的两条单链dna组成。
4.检测辣椒pmmov抗病性的方法，包括：检测待测辣椒的基因组dna中对应于序列表中seq id no.1的第53-65位的核苷酸，基因组dna中对应于序列表中seq id no.1的第53-65位的核苷酸为ttttttttttttt的纯合待测辣椒pmmov抗病或候选pmmov抗病，基因组dna中对应于序列表中seq id no.1的第53-65位的核苷酸为ttttttttttttt与tttttttttt的杂合待测辣椒pmmov抗病或候选pmmov抗病，基因组dna中对应于序列表中seq id no.1的第53-65位的核苷酸为tttttttttt的纯合待测辣椒pmmov感病或候选pmmov感病。
5.检测辣椒pmmov抗病性的方法，包括：以待测辣椒的基因组dna为模板，利用权利要求3中所述引物对进行pcr扩增，得到pcr产物；检测所得扩增产物的大小，扩增产物含有112bp的dna片段且不含109bp的dna片段的待测辣椒pmmov抗病或候选pmmov抗病；扩增产物含有112bp与109bp的两条dna片段的待测辣椒pmmov抗病或候选pmmov抗病；扩增产物含有109bp的dna片段且不含112bp的dna片段的待测辣椒pmmov感病或候选pmmov感病。
6.检测辣椒pmmov抗病性的方法，包括：以待测辣椒的基因组dna为模板，利用权利要求3中所述引物对进行pcr扩增，得到pcr产物；检测所得扩增产物的序列，扩增产物含有seqid no.1所示dna片段且不含seq id no.2所示dna片段的待测辣椒pmmov抗病或候选pmmov抗病；扩增产物含有seq id no.1与seq id no.2所示的两条dna片段的待测辣椒pmmov抗病或候选pmmov抗病；扩增产物含有seq id no.2所示dna片段且不含seq id no.1所示dna片段的待测辣椒pmmov感病或候选pmmov感病。
7.权利要求1-3中任一所述检测所述辣椒pmmov抗病性分子标记的物质。
8.权利要求1-3中任一所述检测所述辣椒pmmov抗病性分子标记的物质在制备检测或辅助检测辣椒pmmov抗病性产品中的应用。
9.权利要求1-3中任一所述检测所述辣椒pmmov抗病性分子标记的物质在辣椒育种中的应用。
10.权利要求1中所述辣椒pmmov抗病性分子标记在辣椒育种中的应用。
技术总结
本发明公开了一种与辣椒抗PMMoV紧密连锁的分子标记及其应用。本发明公开的分子标记为辣椒基因组中对应于序列表中SEQ ID No.1的第53‑65位的核苷酸，其为TTTTTTTTTTTTT或TTTTTTTTTT。实验证明，基因组DNA中对应于序列表中SEQ ID No.1的第53‑65位的核苷酸为TTTTTTTTTTTTT的纯合辣椒以及为TTTTTTTTTTTTT与TTTTTTTTTT的杂合辣椒PMMoV抗病，基因组DNA中对应于序列表中SEQ ID No.1的第53‑65位的核苷酸为TTTTTTTTTT的纯合辣椒PMMoV感病。表明，本发明的分子标记可用于辣椒育种。
技术研发人员：程青,杨涵矞,惠涵,沈火林
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5