一种草鱼出血病和败血症二联亚单位疫苗的制备和应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种草鱼出血病和败血症二联亚单位疫苗的制备和应用。

背景技术：

1、水产养殖业是农业经济的重要组成部分。草鱼作为较为最重要的淡水养殖品种，草鱼出血病和细菌性败血症是目前养殖草鱼的主要病害。

2、草鱼出血病病原gcrv病毒颗粒组成主要包括蛋白质和核酸，含少量糖类，不含类脂；反复冻融对病毒感染力有较大影响。gcrv病毒颗粒由多层排列，呈正二十面球体，直径约55～80nm，无囊膜结构，外衣壳由200个的三聚体按t＝13排列构成，内衣壳由120个单体按t＝1排列构成。gcrv分离株主要可以分为3种基因型，包括gcrv-ⅰ型、gcrv-ⅱ型和gcrv-ⅲ型。由于毒株间基因组序列的差异，各毒株的细胞培养特性、毒力、致病性和抗原性各不相同。流行病学调查结果表明，以gcrv hunan1307和gcrvgd108为代表的ii型毒株是目前引起草鱼出血病最主要的流行毒株。

3、维氏气单胞菌(aeromonas)作为条件致病菌，是引发淡水鱼类、虾蟹、贝类细菌性败血症的主要病原菌，使其出现免疫力下降、出血、腹水、眼球突出及肠炎等症状，给水产养殖业造成巨大的经济损失。维氏气单胞菌引起淡水鱼类细菌性败血症的报道逐渐增多，维氏气单胞菌的毒力表现在多方面，不仅与毒力基因有关，同时还包括表面相关分子、运动、生物活性细胞外产物和生物膜的形成。

4、草鱼呼肠孤病毒和维氏气单胞菌都可引起草鱼出血死亡，常常伴随混合感染或继发感染，然而目前尚没有能够同时有效预防和控制两种疫病发生都有效方法。

5、现有疫苗的类型及存在的问题：

6、草鱼出血病组织匀浆灭活疫苗，通过将发病草鱼组织匀浆灭活后制备的土法疫苗，虽然有效，但是存在疫苗成分和含量不稳定的问题，此外还存在灭活不彻底的可能，以上问题造成草鱼出血病组织匀浆灭活疫苗的使用保护效果不稳定，使用后还存在大规模爆发疫病的风险。草鱼出血病细胞培养病毒灭活疫苗虽然安全可靠，但是由于病毒滴度较低导致疫苗成本高、且无法实现多联多价疫苗制备。

7、减毒疫苗又称弱毒疫苗或活疫苗，是应用减毒或无毒的活病原微生物制成。与灭活疫苗(死疫苗)相比，这类疫苗免疫力强、作用时间长，但需冷冻保存、存在致病性、刺激性过强和回复致病性的潜在危险。且查阅相关资料，目前获批使用的为gcrv-i毒株制备的弱毒疫苗，并没有关于gcrv-ii的减毒疫苗的研发。综上，弱毒活疫苗，安全性较低，存在毒力返强的风险；且获得生产批号的草鱼出血病活疫苗由于流行毒株发生变化，保护效果较差；维氏气单胞菌由于存在多种血清型，因此目前的单价的草鱼细菌性败血症减毒疫苗的交叉保护效果也不理想。

8、基因工程亚单位疫苗是利用基因重组技术，将抗原蛋白基因在体外表达并纯化获得只含有一种或几种主要抗原成分而制备的疫苗。它的优点是抗原成分比较单一，没有毒力因子和其他遗传信息，不会在机体内复制，对宿主没有感染性，安全性和稳定性高。目前，已有很多研究报道了关于草鱼出血病的亚单位疫苗，并且在实验条件下取得了良好的效果，但亚单位疫苗普遍存在保护率较低的情况，且目前尚无草鱼重要病害多联多价疫苗。

9、核酸疫苗利用编码抗原蛋白的目的片段进到动物体内，选择其表达系统得到蛋白，诱导产生免疫应答和较好的保护效果。dna疫苗与传统疫苗相比制备相对简单，生产成本低，使用时不需要添加佐剂，稳定性好，免疫效率高且持续时间长。但dna 疫苗安全问题也存在争议，如dna在体内不可控，可能会整合到宿主基因组上，存在遗传及免疫耐受的风险。

10、目前已有疫苗总结：

11、表1

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13、

14、

15、草鱼呼肠孤病毒和维氏气单胞菌都可引起草鱼出血死亡，常常伴随混合感染或继发感染，对于草鱼出血病、败血症来说，预防是最有效的方法之一。并且免疫防治不会出现药物防治所带来的破坏环境的问题，免疫防治不仅安全而且成效也好于药物防治，所以研制有效的疫苗对草鱼出血病、白血病的防治具有深远的意义。

16、因此为了有效控制草鱼出血病的发生应该同时控制两种病原体的出现，本发明即以此为指导进行二联亚单位疫苗的研制，以期一针多防，联防联控同时控住草鱼呼肠孤病毒和维氏气单胞菌的发生，减少草鱼出血病、败血症带来的危害。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供一种融合基因。

2、本发明第二方面的目的，在于提供上述融合基因表达的融合蛋白。

3、本发明第三方面的目的，在于提供包含上述融合基因或表达上述融合蛋白的重组表达载体、表达盒或重组菌。

4、本发明第四方面的目的，在于提供上述融合基因、融合蛋白、重组表达载体、表达盒或重组菌的应用。

5、本发明第五方面的目的，在于提供一种产品。

6、本发明所采取的技术方案是：

7、本发明的第一方面，提供一种融合基因，所述融合基因中含有草鱼呼肠孤病毒的vp6基因序列和维氏气单胞菌ompaⅱ基因序列。

8、优选地，所述融合基因还包括接头序列。

9、优选地，所述接头包括柔性接头、刚性接头或可剪切接头。

10、优选地，所述柔性接头的序列为ggtggcggtggctca。

11、优选地，所述融合基因的核苷酸序如seq id no.1所示。

12、本发明的第二方面，提供一种融合蛋白，所述融合蛋白由本发明第一方面所述的融合基因编码。

13、本发明的第三方面，提供含有如本发明第一方面所述的融合基因或本发明第二方面所述的融合蛋白的重组表达载体、表达盒或重组菌。

14、优选地，所述表达载体包括但不限于pet系列、duet系列、pgex系列、phy300、phy300plk、ppic系列。

15、优选地，所述表达载体为pet32a载体。

16、优选地，所述重组菌包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌。

17、优选地，所述重组菌为重组大肠杆菌，分类命名为大肠氏菌pet32a-vp6-ompa ii/bl21(escherichia coli pet32a-vp6-ompa ii/bl21)，保藏于位于中国武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2024年05月17日；保藏编号是cctcc no：m 2024974。

18、本发明还提供上述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：构建含有编码上述融合基因的重组载体；将所述的重组载体转入感受态细胞中，筛选阳性克隆后进行培养，诱导表达，提取、纯化蛋白，得到融合蛋白。

19、本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述的融合基因或本发明第二方面所述的融合蛋白或本发明第三方面的重组表达载体、表达盒或转基因重组菌在制备防治草鱼呼肠孤病毒和/或维氏气单胞菌引起的疾病的产品中的应用。

20、优选地，所述草鱼呼肠孤病毒和/或维氏气单胞菌引起的疾病包括草鱼出血病和/或草鱼败血症。

21、优选地，所述产品还包括佐剂。

22、优选地，所述产品为药物。

23、优选地，所述药物为疫苗。

24、优选地，所述疫苗为亚单位疫苗。

25、优选地，所述药物的给药途径包括腹腔注射、肌肉注射。

26、优选地，所述佐剂包括isa763a、氢氧化铝、卵磷脂、弗氏佐剂、mpltm、il-12、isa51vg、isa720vg、mf59、qs21、as03佐剂中的至少一种。本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他的免疫佐剂用于制备适合使用的疫苗。

27、本发明的第五方面，提供一种产品，所述产品包括本发明第一方面所述的融合基因或本发明第二方面所述的融合蛋白或本发明第三方面的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或转基因重组菌。

28、优选地，所述产品还包括佐剂。

29、优选地，所述产品为药物。

30、优选地，所述药物为疫苗。

31、优选地，所述疫苗为亚单位疫苗。

32、优选地，所述药物的给药途径包括腹腔注射、肌肉注射。

33、优选地，所述佐剂包括isa763a、氢氧化铝、卵磷脂、mpltm、il-12、isa51vg、isa720vg、mf59、qs21、as03佐剂中的至少一种。本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他的免疫佐剂用于制备适合使用的疫苗。

34、本发明还提供上述亚单位疫苗的制备方法，包括将纯化后的融合蛋白与佐剂混合。

35、优选地，所述融合蛋白与佐剂的质量比为1:0.5～2。

36、本发明的有益效果是：

37、本发明提供了一种由gcrv的vp6蛋白和维氏气单胞菌的外膜蛋白ompaii连接获得的融合基因，将该融合基因表达融合蛋白对实验动物进行腹腔注射免疫，采集脾脏和肾组织，通过qpcr测定各组织中免疫相关基因的表达量水平；结果表明所制备的二联亚单位疫苗通过注射免疫能够刺激鱼体不同免疫组织产生免疫应答反应；在免疫后第28d，腹腔注射gcrv强毒及维氏气单胞菌进行鱼体攻毒实验，攻毒后15天，对维氏气单胞菌和草鱼呼肠孤病毒感染相对存活率(rps)分别为85％和55％，表明本发明二联亚单位疫苗对养殖草鱼重要病害均具有较好的保护效果。

技术特征：

1.一种融合基因，所述融合基因中含有草鱼呼肠孤病毒的vp6基因序列和维氏气单胞菌ompaⅱ基因序列。

2.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述融合基因还包括接头序列；优选地，所述接头包括柔性接头、刚性接头或可剪切接头。

3.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述融合基因的核苷酸序如seq idno.1所示。

4.一种融合蛋白，所述融合蛋白由权利要求1～3任一项所述的融合基因编码。

5.含有如权利要求1～3任一项所述的融合基因或权利要求4所述的融合蛋白的重组表达载体、表达盒或重组菌。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在在于，所述重组菌为重组大肠杆菌；优选地，所述重组大肠杆菌的分类命名为大肠氏菌pet32a-vp6-ompa ii/bl21(escherichia.colipet32a-vp6-ompa ii/bl21)，保藏编号是cctcc no：m 2024974。

7.权利要求1～3任一项所述的融合基因或权利要求4所述的融合蛋白或权利要求5～6任一项所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在制备防治草鱼呼肠孤病毒和/或维氏气单胞菌引起的疾病的产品中的应用；优选地，所述草鱼呼肠孤病毒和/或维氏气单胞菌引起的疾病包括草鱼出血病和/或草鱼细菌性败血症。

8.一种产品，所述产品包括权利要求1～3任一项所述的融合基因或权利要求4所述的融合蛋白或权利要求5～6任一项所述的重组表达载体、表达盒或重组菌。

9.根据权利要求7所述的应用或权利要求8所述的产品，其特征在于，所述产品为药物；所述药物优选为疫苗；更优选为亚单位疫苗。

10.根据权利要求9所述的应用或产品，其特征在于，所述疫苗包括佐剂；优选地，所述佐剂包括isa763a、氢氧化铝、卵磷脂、mpltm、il-12、isa51vg、isa720vg、mf59、qs21、as03佐剂中的至少一种；优选地，所述药物的给药途径包括腹腔注射、肌肉注射。

技术总结
本发明公开了一种草鱼出血病和败血症二联亚单位疫苗的制备和应用。本发明提供了一种由GCRV的VP6蛋白和维氏气单胞菌的ompAII蛋白连接获得的融合基因，将该融合基因表达融合蛋白联合佐剂构建二联亚单位疫苗对实验动物进行腹腔注射免疫，采集脾脏和肾组织，测定各组织中免疫相关基因的表达量水平；结果表明所制备的二联亚单位疫苗通过注射免疫能够刺激鱼体不同免疫组织产生免疫应答反应；在免疫后第28d，腹腔注射GCRV强毒及维氏气单胞菌进行鱼体攻毒实验，攻毒后15天，对维氏气单胞菌和草鱼呼肠孤病毒感染相对存活率分别为85％和55％，表明本发明二联亚单位疫苗对养殖草鱼重要病害均具有较好的保护效果。

技术研发人员：尹纪元,王庆,李威,张德锋,王英英,李莹莹,莫绪兵,任燕,潘厚军
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院珠江水产研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5