一种检测三尖盘头线虫的Taqman探针qPCR试剂盒及其检测方法和应用与流程
本发明涉及生物医药，特别是涉及一种检测三尖盘头线虫的taqman探针qpcr试剂盒及其检测方法和应用。
背景技术：
1、三尖盘头线虫(ollulanus tricuspis)属于线虫门、胞管肾纲、圆线虫目、莫林线虫科中的一种蠕虫。三尖盘头线虫1865年首次在德国被发现，目前在欧洲、美洲、澳大利亚和中东呈广泛性分布，国内也有流行，但尚未见确切的文献数据报道。三尖盘头线虫主要感染猫科动物，最常见于家猫或流浪猫，偶尔发生在流浪犬、猪和狐狸中。三尖盘头线虫的成虫体积非常小，雄性只有0.7-0.8mm长，雌性只有0.8-1mm长，成虫可通过其头部的螺旋线圈和雌虫后端的三尖瓣在显微镜下进行鉴别。
2、三尖盘头线虫多寄生于胃，可钻入胃粘膜。幼虫在雌虫子宫内发育为三期幼虫，4-5周内可在胃中发育为成虫，一经释放，即具感染性，形成自身感染，可通过患病动物的呕吐物进行传播。dennis 2006年的研究指出，三尖盘头线虫对猫的致病潜力一直存在争议，一些研究员认为多数患病猫无临床症状表现，偶尔表现为呕吐、厌食、消瘦或卡他性胃炎，对临床病例的影响不大，但也有证据表明其能引起严重胃病。值得注意的是，三尖盘头线虫引起的慢性感染和炎症可能会导致或加剧胃腺癌的发展，尤其是在有其他环境和遗传因素的情况下。
3、三尖盘头线虫的诊断常需要内窥镜检及胃黏膜活检相配合，因为三尖盘头线虫可引起不可见的黏膜病变。治疗多使用抗寄生虫药，如苯咪唑，但可复发，因此需持续监测并重复治疗。对三尖盘头线虫的临床重要性还需要进一步研究，尤其是关于其在慢性胃炎中的作用及其与胃肿瘤的潜在联系。
4、collet在2000年的研究指出，粪便漂浮法或沉淀法通常无法有效检测三尖盘头线虫，因为成虫在肠道中因高ph值被消化，随粪便外排前通常已死亡。基于上述情况，粪便中难以检测到虫体或虫卵。目前，baermann法是一种通过滤网过滤样本，获得虫体的诊断方法，该方法常用于线虫诊断，是目前三尖盘头线虫诊断的金标准，但其灵敏度常低于90％，且需大量虫体才能有效确认。cecchi 2006年在对呕吐和体重减轻的猫进行内窥镜检查时收集了活检样本，用组织病理学方法，通过he(haemotoxylin and eosin)染色鉴定出三尖盘头线虫。但作者指出，he染色有时会因人为的细胞碎片而难以识别样本中的虫体。
5、一些研究(包括cecchi，2006、dennis，2006、collett，2000和simpson，2006)称，在犬/猫的胃中零星地检测到各种线虫，包括三尖盘头线虫、狼尾旋线虫(spirocerca lupi)、泡翼线虫属(physaloptera spp.)和aonchotheca putorii。上述寄生虫常伴有肉芽肿病变，而在三尖盘头线虫引起的感染中尚未发现此类病变。2020年nagamori等人对猫群流行病学调查显示，对2586份粪便样本进行粪便漂浮或沉淀、抹片镜检、baermann法等检测，结果显示约24.5％的猫有寄生虫感染，其中混合感染2种及以上的占5.7％，三尖盘头线虫感染率约0.12％(3/2586)。2015年takeuchi-storm等人另一项报告对99只猫样本进行尸检，超过90％的猫鉴定有寄生虫感染，其中三尖盘头线虫的感染率达13.1％，此外线虫、吸虫和绦虫均有感染。
6、蠕虫类寄生虫各发育阶段结构类似，尤其在同科或相关属中，用粪便漂浮法结合显微镜检查常难以区分，如泡翼线虫属与三尖盘头线虫形态类似，通常泡翼线虫属体型稍大，但低倍镜下与三尖盘头线虫大致相同，可能会导致混淆。此外狼尾旋线虫常寄生于食道，体型较大，但在早期检查时，与泡翼线虫属较为相似。三尖盘头线虫与上述蠕虫均可引起胃肠道疾病，镜检时需根据其形态特征(如大小、形状及解剖结构)仔细区分。正确鉴别不同虫体对诊断人员的兽医寄生虫学经验背景和技术有较高要求，且步骤较多，不易量化。
7、目前，对三尖盘头线虫的诊断尚未开发出分子生物学的诊断方法，仍处于基于寄生虫形体特性诊断的病原学检测，无法克服其低敏感性和特异性的劣势，耗时且难以与其他易混合感染的线虫等鉴别区分。基于上述问题，本技术提出了基于三尖盘头线虫的28srrna基因序列设计引物的taqman探针qpcr方法来特异性检测这种犬和/或猫中的常见线虫。28s rrna是一种真核生物核糖体基因，在基因组中具有多拷贝，可以提高qpcr检测的灵敏度。28s rrna基因序列中包含易于引物结合的保守区和种属特异的可变区，可保证检测的特异性。28s rrna在线虫的分类和遗传检测中已被广泛使用，是分子检测中可靠、有效的靶基因。本方法具有快速、灵敏、特异、经济的优点，简化了临床镜检的步骤，节省了临床检测的人力和时间，可以实现对三尖盘头线虫的高通量的早期检测。
技术实现思路
1、本发明主要解决的技术问题是提供一种检测三尖盘头线虫的taqman探针qpcr试剂盒及其检测方法和应用，本发明的检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好，检测限低的特点，可用于对犬和/或猫中病原体，尤其是线虫的检测。
2、为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种检测三尖盘头线虫的taqman探针qpcr试剂盒，所述试剂盒包括用于检测三尖盘头线虫的正向引物、反向引物和taqman探针，其中，所述正向引物的序列如seq id no.1所示，反向引物的序列如seq idno.2所示，taqman探针的序列如seq id no.3所示。
3、优选地，所述试剂盒包括阳性对照，所述阳性对照为重组质粒。
4、优选地，所述重组质粒的序列如seq id no.4所示。
5、优选地，所述试剂盒还包括premix ex taq和ddh2o。
6、本发明公开了一种检测三尖盘头线虫的qpcr反应体系，所述反应体系包括0.2μl浓度为10μm的正向引物、0.2μl浓度为10μm的反向引物、0.2μl浓度为20μm的taqman探针、5μl dna模板、10μl上述的premix ex taq以及4.4μl上述ddh2o；其中，所述正向引物的序列如seq id no.1所示，反向引物的序列如seq id no.2所示，taqman探针的序列如seq id no.3所示。
7、本发明还公开了上述试剂盒的检测方法，具体步骤如下：
8、s1：采集并提取样品的dna；
9、s2：配制权利要求5所述的qpcr反应体系，作为待测样本；
10、s3：进行荧光定量pcr反应。
11、优选地，所述s3中pcr反应包括95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火延伸31s；进行40个循环。
12、本发明还公开了上述试剂盒在检测犬和/或猫中病原体的应用。
13、本发明的有益效果是：
14、(1)本发明方法简单、操作方便快捷、引物设计的局限性小，数据分析更加简单直观，并且整个实验过程可在2h内完成；
15、(2)本发明的方法敏感性高、特异性强、重复性好，检测限低至55.8拷贝/反应，且探针法只与目的序列结合，显著提高了敏感性和特异性；实时监控荧光数据，避免了琼脂糖凝胶电泳和污染，确保了实验结果的可靠性和准确性。
技术特征：
1.一种检测三尖盘头线虫的taqman探针qpcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测三尖盘头线虫的正向引物、反向引物和taqman探针，其中，所述正向引物的序列如seq id no.1所示，反向引物的序列如seq id no.2所示，taqman探针的序列如seq id no.3所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括阳性对照，所述阳性对照为重组质粒。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述重组质粒的序列如seq id no.4所示。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括premix ex taq和ddh2o。
5.一种检测三尖盘头线虫的qpcr反应体系，其特征在于，所述反应体系包括0.2μl浓度为10μm的正向引物、0.2μl浓度为10μm的反向引物、0.2μl浓度为20μm的taqman探针、5μldna模板、10μl如权利要求4所述的premix ex taq以及4.4μl如权利要求4所述的ddh2o；其中，所述正向引物的序列如seq id no.1所示，反向引物的序列如seq id no.2所示，taqman探针的序列如seq id no.3所示。
6.一种如权利要求1-4任一项所述的试剂盒的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述s3中pcr反应包括95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火延伸31s；进行40个循环。
8.权利要求1-4任一项所述的试剂盒在检测犬和/或猫中病原体的应用。
技术总结
本发明公开了一种检测三尖盘头线虫的Taqman探针qPCR试剂盒及其检测方法和应用，所述试剂盒包括用于检测三尖盘头线虫的正向引物、反向引物和Taqman探针，其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，Taqman探针的序列如SEQ ID NO.3所示；所述试剂盒还包括阳性对照、Premix Taq和ddH2O，所述阳性对照为重组质粒，序列如SEQ ID NO.4所示；本发明的方法简单、操作方便快捷，可将其用于犬和/或猫病原体的检测，具有敏感性高、特异性强、重复性好和检测限低的特点。
技术研发人员：芭菈蒂,王昱,鲍枳月,杨玲焰,时长军
受保护的技术使用者：苏州西山生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5