一种腺病毒载体疫苗及其制备方法和应用与流程
本发明涉及疫苗，具体涉及一种人工改造的腺病毒载体疫苗的制备方法和应用。更具体地，涉及一种利用包含降低腺载体表面电荷的非注射用的腺载体疫苗。
背景技术：
1、腺病毒(ads)包含在两栖动物、禽类和哺乳动物中发现的、具有无包被的二十面体衣壳结构的双链dna病毒的大家族，其良好分子遗传学表征，使得腺病毒载体成为用作疫苗载运体(carrier)的好的候选者，重组腺病毒载体的生产依靠使用能够补足腺病毒基因产物的功能的包装细胞系。腺病毒无包膜，20面体对称，有252壳粒。其中20面顶角壳粒为12个五邻体(penton)，每个五邻体有2条纤维，除五邻体外有240个非顶角壳粒，称为六邻体(hexon)，带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇。六邻体蛋白的结构特异性，编码中和表位，参与免疫反应。截止目前已经从宿主中分离到101种腺病毒。
2、目前，两种良好表征的人类c亚群腺病毒血清型(即，had2和had5)被广泛地用作大多数用于基因治疗的腺病毒载体的病毒主干的来源。也已经测试了复制缺陷性人类腺病毒载体作为用于递送各种免疫原的疫苗载体，所述免疫原来源于各种传染原(例如，病毒、寄生虫或细菌性病原体)和肿瘤细胞，包括肿瘤相关抗原(taa)。随着复制缺陷性人类腺病毒载体应用的逐步增加，其带来的两个相关问题是，预存免疫(pre-existing immunity)和产生有复制能力的腺病毒(rca)污染的风险。
3、为了解决上述问题，黑猩猩腺病毒载体或人腺病毒载体的人其他罕见血清型的出现提供了一条路径，然新类型腺病毒载体的开发出现诸多安全性问题，在新冠疫苗的开发中，阿斯利康的疫苗采用黑猩猩chadox1腺病毒作为载体，欧洲药品管理局发表声明称其下属的药物警戒风险评估委员会认定，伴有血小板减少的异常血栓症状应被列为阿斯利康新冠疫苗非常罕见的副作用。后期英国卡迪夫大学和美国的联合研究团队在scienceadvances上发布的一篇文章揭示了阿斯利康疫苗可能导致血栓的机理，英美联合团队认为，导致血栓的罪魁祸首很可能是阿斯利康疫苗使用的腺病毒载体chadox1与pf4(血小板因子4)相互作用，错误的触发免疫系统释放抗pf4抗体并在血液中堆积造所导致。pf4参与hit(血小板减少症)的病理机制，hit具有与tts(血小板减少症候群)相似的临床表现，chadox1还能与pf4形成稳定的复合物，具有高电负性；在一项布朗动力学(bd)模拟中，自由扩散的pf4经常接触六邻体之间chadox1的衣壳表面，最常见的是在三个六邻体的界面处，相对比强生新冠疫苗采用的另外一种腺病毒载体ad-26也与pf4形成接触，但频率较低。这导致美国疾病控制中心和食品药品监督管理局建议先暂停使用该疫苗，在内布拉斯加州大学医学中心研究显示，强生新冠疫苗造成血栓的原因，基本与阿斯利康新冠疫苗一致。
4、显然腺病毒的应用虽然历时已久，但显然目前的研究对腺病毒的风险认识不足，腺病毒存在尚未预知的风险。基于多种类型腺病毒载体出现的问题，本发明人致力于针对腺病毒载体进行改造，以解决其安全性问题。
技术实现思路
1、为实现上述目的，本发明人针对腺病毒的改造开展多项生物学实验，经过多次实验明确腺病毒载体的改造方法。提供一种重组腺病毒及其改造方法。
2、具体的提供一种重组腺病毒，所述腺病毒的六邻体蛋白中1个或多个带负电荷氨基酸被突变为成中性氨基酸或正电荷氨基酸。
3、所述腺病毒的六邻体蛋白的突变区域为腺病毒六邻体蛋白的超变区hvr；
4、所述腺病毒六邻体蛋白的超变区hvr包括hvr1、hvr2、hvr3、hvr4、hvr5、hvr6、hvr7中的一种或多种；
5、所述负电荷氨基酸为天冬氨酸和/或谷氨酸；
6、所述中性氨基酸选自天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸中的一种或多种；
7、所述中性氨基酸选自为缬氨酸v、亮氨酸l、天冬酰胺n、谷氨酰胺q、异亮氨酸i中一种或多种；
8、所述正电荷氨基酸选自精氨酸r、赖氨酸k、组氨酸h中的一种或多种；
9、腺病毒六邻体处与pf4结合，六邻体的前段和中段，有大量的抗原性高峰及较密的亲水性高峰区，该区域含有大量的保守区，保守区疏水性氨基酸较多，他们成为维持六邻体的空间结构骨架的关键氨基酸，对二级结构的形成十分重要。针对腺病毒的改造必须基于维持合理结构，保证腺病毒基础功能，同时解决和pf4互作的问题。
10、本发明的重组腺病毒载体可以用基因治疗、肿瘤免疫接种和/或抗病毒免疫接种。本发明所述重组腺病毒载体可用于基因输送，腺病毒颗粒可以被特异导向感兴趣的靶细胞，腺病毒通过壳体—受体结合或其它方式与该特异靶细胞结合并输送转基因。
11、本发明还提供一种组合物，包含通过上述方法改造的重组腺病毒载体。
12、本发明的有益效果包括：
13、1、本发明提供一种重组腺病毒，所述重组腺病毒表面电荷改变，可减少同pf4互作的概率，解决腺病毒的安全性问题，降低腺病毒在应用中引发的血栓事件的发生概率。
14、2、本发明的一个方面，本发明的重组腺病毒载体制备成用于递送各种免疫原的疫苗载体，且免疫效果优于现有常用腺病毒载体。
15、3、本发明的一个方面，本发明的重组腺病毒载体可以用于基因治疗、肿瘤免疫接种和/或抗病毒免疫接种，可用于基因输送，腺病毒颗粒可以被特异导向感兴趣的靶细胞，腺病毒通过壳体—受体结合或其它方式与该特异靶细胞结合并输送转基因。
16、4、本发明的一个方面，基于本发明重组腺病毒载体制备的组合物，临床应用中相关副作用较少，安全性较高。
17、5、本发明的一个方面，经过改造的重组腺病毒可开发黏膜给药制剂，例如，通过吸入方式接种，模拟病毒侵染过程，激发产生免疫反应。可以避免肌肉注射所带来的注射部位疼痛等局部不良反应，通过吸入至肺的方式，可使雾化后的疫苗经过呼吸道最终抵达肺部，在产生体液免疫和细胞免疫的同时，激发呼吸道黏膜免疫。本发明黏膜给药制剂，较注射不仅具有顺应性，而且给药剂量更低，还可产生体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫的三重保护效果。
技术特征：
1.一种重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒的六邻体蛋白的超变区hvr中1个或多个带负电荷氨基酸被突变为中性氨基酸和/或正电荷氨基酸。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述六邻体蛋白的超变区hvr包括hvr1、hvr2、hvr3、hvr4、hvr5、hvr6、hvr7中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述重组腺病毒，其特征在于，所述六邻体蛋白的超变区hvr的突变区域至少包括hvr2和/或hvr7。
4.根据权利要求1-3中任一项所述重组腺病毒，其特征在于，所述带负电荷氨基酸为天冬氨酸d和/或谷氨酸e。所述中性氨基酸选自为缬氨酸v、亮氨酸l、天冬酰胺n、谷氨酰胺q、异亮氨酸i中一种或多种；所述正电荷氨基酸选自精氨酸r、赖氨酸k、组氨酸h中的一种或多种。
5.根据权利要求1-4中任一项所述重组腺病毒，其特征在于，所述超变区hvr中至少一个带负电荷氨基酸突变为中性氨基酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒六邻体蛋白的突变区域为：hvr1的d144和/或e159或其相当位置；hvr2的d171和/或d175和/或d177或其相当位置；hvr5的d265或其相当位置；和/或hvr7的d423和/或d425和/或e427和/或e429或其相当位置。
7.一种制造如权利要求1-6中任一项所述重组腺病毒的方法，其特征在于，包括将所述重组腺病毒导入互补细胞，培养细胞并收获病毒。
8.一种如权利要求1-6中任一项所述重组腺病毒在制备药物中的用途，其特征在于，包括基因治疗、肿瘤免疫接种和/或抗病毒免疫接种。
9.一种如权利要求1-6中任一项所述重组腺病毒在制备药物中的用途，其特征在于，包括在人或哺乳动物中引发初级免疫反应，引发加强免疫反应或用于破坏宿主对自体抗原的耐受性的用途。
10.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1-6中任一项所述的重组腺病毒，和至少一个异源转基因，所述异源转基因包载病毒或细菌抗原。
11.一种如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述的病毒或细菌抗原选自：hiv、狂犬病病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、冠状病毒、人乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、带状疱疹病毒(vzv)、巨细胞病毒、2型单纯疱疹病毒、爱泼斯坦巴尔病毒、人偏肺病毒、副流感病毒、感病毒、克氏锥虫和恶性疟原虫、结核杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、nthi嗜血流感菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺旋杆菌、沙眼衣原体的一种或多种。
12.如权利要求10-11中任一项所述的组合物，其特征在于，包括药学上可接受的辅料，优选的，所述的药学上可接受的辅料选自：缓冲剂、保护剂、稳定剂、表面活性剂、渗透压调节剂、佐剂、防腐剂、灭活剂中的一种或多种。
13.如权利要求10-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述的组合物为黏膜免疫制剂、体液免疫制剂、细胞免疫制剂、皮肤免疫制剂。
14.如权利要求13中任一项所述的组合物，其特征在于，黏膜免疫制剂为液体剂型、固体剂型、半固体剂型、气体剂型、吸入剂型。
15.一种根据权利要求10-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述的组合物为给药制剂，优选的，所述的给药制剂为静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射剂、口服给药剂、口腔给药剂、舌下给药剂、直肠给药剂、呼吸道给药剂、经皮给药剂；优选地，为呼吸道给药制剂，为经口吸入、经鼻吸入或经雾化给药装置雾化后吸入制剂。
16.根据权利要求10-15中任一项所述的组合物在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于以下用途的一种或多种：基因治疗，肿瘤免疫接种，抗病毒免疫接种，递送转基因至宿主细胞中，用在人或动物中引发初级免疫反应，在人或动物中加强免疫反应，在人或动物中诱导打破针对自体抗原的耐受性的免疫反应。
17.一种制造权利要求10-15中任一项所述的组合物的方法，其特征在于，其包含提供异源基因的蛋白质或其片段的核酸的，使所述重组腺病毒在宿主细胞中增殖，分离并纯化该重组腺病毒，并将该重组腺病毒调配成医药学上可接受的组合物。
技术总结
本发明涉及一种改造的重组腺病毒及其制备方法和应用，该腺病毒载体经改造后可降低腺病毒颗粒表面负电荷水平，进而降低了腺病毒载体与PF4(血小板因子4)的相互作用。经改造的腺病毒载体给药后可降低血栓发生的风险，提升疫苗安全性与有效性，更适合于老人，小儿和孕妇等高风险人群。本发明重组腺病毒可广泛用于基因治疗、肿瘤免疫接种和/或抗病毒免疫接种，包括在人或哺乳动物中引发初级免疫反应，引发加强免疫反应，用于破坏宿主对自体抗原的耐受性的用途。经过改造的重组腺病毒可开发黏膜给药制剂。本发明黏膜给药制剂，较注射不仅具有顺应性，而且给药剂量更低，还可产生体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫的三重保护效果。
技术研发人员：邵娟,曹龙龙,隋秀文,齐源远,童童,吴丹,徐志君,赵佳雨,魏梦函,马新建,朱涛
受保护的技术使用者：康希诺生物股份公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5