人间充质干细胞诱导软骨分化培养基及其制备和使用方法与流程

本发明属于培养干细胞，具体涉及一种人间充质干细胞诱导软骨分化培养基及其制备和使用方法。

背景技术：

1、干细胞是目前生物医药行业最热门的方向之一；干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成为多种功能性细胞。根据干细胞所在的发育阶段可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞多分为间充质干细胞，其来源丰富，分化能力也很强，在特定条件下具备良好的单方向分化能力，因而在再生医学上应用广泛。

2、间充质干细胞在特定条件下可以分化为软骨细胞或者软骨前体细胞,目前大多研究间充质干细胞分化软骨倾向于三维空间成细胞球来培养,但是成球培养获得的软骨细胞由于其体积较大、不易消化等特性很难将分化形成的软骨细胞注射进软骨损伤部位进行治疗，同时在进行间充质干细胞分化软骨培养过程中也存在耗时较长的问题。因此，为获得足量的间充质干细胞来源的软骨细胞进行临床应用，需通优化特定培养条件，进行定向分化诱导，从而在短期内高效获得充足且均一的软骨组织细胞进行损伤修复。而现有人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基在高糖dmem培养基基础上，添加了10％胎牛血清(fbs)，1mm丙酮酸钠，20ug/ml脯氨酸，1xits，50μg/ml抗坏血酸，100nm地塞米松，以及10ng/ml tgf-β，该培养基用来诱导其代间充质干细胞成球分化软骨细胞，且分化培养时间持续3-5周，分化效率较低，且分化得到的软骨细胞球不易通过注射进行临床试验治疗，应用价值较低。

3、本研究通过改变间充质干细胞分化软骨细胞培养过程中的诱导因子,使得间充质干细胞在平面培养过程中可以更高效的分化为软骨细胞,同时也缩短了间充质干细胞因子分化软骨细胞的培养时间。

4、因此，为了解决上述问题，本文提出一种人间充质干细胞诱导软骨分化培养基及其制备和使用方法。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明设计了一种人间充质干细胞诱导软骨分化培养基及其制备和使用方法，在现有的成软骨诱导分化培养基添加了肝细胞生长因子(hgf)，能特异的作用于形成的软骨细胞，对其具有趋化性和致有丝分裂活性，并促软骨细胞合成基质，从而进一步高效促进人间充质干细胞向软骨细胞特异性分化。

2、为了达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现的：一种人间充质干细胞诱导软骨分化培养基，其特征在于，包括以下组分：

3、dmem高糖培养基、l-抗坏血酸20-100ug/ml浓度、地塞米松10-200nm浓度、its-a0.5-20％体积百分比、转化生长因子-β3(tgf-β3)0.1-20ng/ml浓度、胰岛素样生长因子-1(igf-1)0.1-100ng/ml浓度、肝细胞生长因子(hgf)0.1～20ng/ml浓度。

4、进一步的，包括以下组分：

5、dmem高糖培养基、l-抗坏血酸50ug/ml浓度、地塞米松100nm浓度、its-a 1x体积百分比、转化生长因子β3(tgf-β3)5ng/ml浓度、胰岛素样生长因子1(igf-1)50ng/ml浓度、肝细胞生长因子(hgf)5ng/ml浓度。

6、本发明的另一目的在于提供一种人间充质干细胞诱导软骨分化培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7、step1、将所需器具耗材分类包装灭菌；

8、step2、试剂母液配制备用；

9、step3、依次将l-抗坏血酸母液、地塞米松母液、转化生长因子-β3(tgf-β3)母液、胰岛素样生长因子-1(igf-1)母液、肝细胞生长因子(hgf)母液、胰岛素-转铁蛋白-硒-丙酮酸钠(its-a)母液加入到dmem高糖培养基中，混合均匀。

10、step4、将混合后的培养液用0.22um滤膜过滤除菌，即得。

11、本发明的另一目的在于提供一种人间充质干细胞诱导软骨分化培养基的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

12、1)细胞复苏：取冻存的脐带间充质干细胞进行复苏，并用友康无血清培养基进行培养；

13、2)消化与传代：将友康无血清培养基培养3天后的细胞用胰酶进行消化，获得脐带间充质干细胞混悬液；

14、3)接种：将得到的混悬液细胞按照对应数量接种于培养皿中，并用友康无血清培养液培养；

15、4)换液：待培养细胞在培养皿中增殖到80％时弃除培养基，用灭菌后的pbs洗去培养皿中残余的培养基，清洗两遍，随后向培养皿中添加间充质干细胞成软骨分化诱导培养基培养细胞；

16、5)分化诱导：用间充质干细胞成软骨分化培养基培养细胞7天，即得软骨细胞。

17、本发明的有益效果是：

18、培养基中的地塞米松可通过活化wnt/β-catenin信号通路上调人间充质干细胞的聚集蛋白聚糖；抗坏血酸可通过活化erk信号，从而激活runx2、sox9等成软骨基因转录，促进二型胶原表达；tgf-β3可通过活化smad2/3/4信号，激活成软骨相关基因转录，促进间充质干细胞成软骨分化；its-a可通过上调sox9基因转录表达，从而促进二型胶原的表达；肝细胞生长因子可以促进间充质干细胞的增殖、迁移以及失巢凋亡诱导的细胞凋亡作用，肝细胞生长因子能特异的作用于形成的软骨细胞，对其具有趋化性和致有丝分裂活性，并促软骨细胞合成基质，从而进一步高效促进人间充质干细胞向软骨细胞特异性分化；

19、本发明提供的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，可以实现人脐带间充质干细胞在二维平面以及3d环境中向软骨细胞的高效诱导分化，分化成软骨细胞的特异性高。与现有技术诱导间充质干细胞分化成软骨细胞所需的3-6周时间相比，本发明提供的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基可以在换液培养一周时间内，使人间充质干细胞出现大量以二型胶原蛋白为代表的的软骨组织细胞外基质，同时使与成软骨分化密切相关的sox-9蛋白表达水平显著上调，缩短人间充质干细胞分化成软骨细胞的诱导时间，同时本发明提供的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基可以更高效的诱导二维平面的间充质干细胞分化软骨细胞，可以更轻易的获得分化软骨细胞混悬液，使得在后期应用中更容易进行注射治疗。此外本发明提供的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基制备方法简便，使用方便，可以实现稳定高效的人间充质干细胞二维平面的成软骨诱导分化。

技术特征：

1.一种人间充质干细胞诱导软骨分化培养基，其特征在于，包括以下组分：

2.根据权利要求1所述的一种人间充质干细胞诱导软骨分化培养基，其特征在于，包括以下组分：

3.根据权利要求1所述的一种人间充质干细胞诱导软骨分化培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求1所述的一种人间充质干细胞诱导软骨分化培养基的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了人间充质干细胞诱导软骨分化培养基及其制备和使用方法，培养器材消毒灭菌，在DMEM高糖培养基中按照所述浓度加入L‑抗坏血酸母液、地塞米松母液、ITS‑A母液、转化生长因子‑β3(TGF‑β3)母液、胰岛素样生长因子‑1(IGF‑1)母液和肝细胞生长因子(HGF)母液，混合均匀后用0.22μm的滤器过滤除菌，置于4℃冰箱中冷藏备用。本发明在现有培养基中加入的肝细胞生长因子可以促进间充质干细胞的增殖、迁移以及失巢凋亡诱导的细胞凋亡作用，肝细胞生长因子能特异的作用于形成的软骨细胞，对其具有趋化性和致有丝分裂活性，并促软骨细胞合成基质，从而进一步高效促进人间充质干细胞向软骨细胞特异性分化。

技术研发人员：杨伟,李天晴,白喜龙,卫思丽,葛晓凡,缑会莉,邱彩娥,刘婷婷,杨莉婷
受保护的技术使用者：西安超越干细胞科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5