一种过氧化氢和磷酸化双响应纳米通道膜及制备和应用
本发明涉及一种利用纳米通道实时监测过氧化氢和磷酸化的方法，具体涉及多肽修饰纳米通道的构筑、过氧化氢和磷酸化的识别和活细胞释放过氧化氢和磷酸化的监测。
背景技术：
1、过氧化氢是人体内一种重要的信号分子，一些蛋白是其下游的效应器，它们被过氧化氢敏感且可逆的氧化，这种效应蛋白通常含有高活性的半胱氨酸(cys)残基，过氧化氢的氧化使其改变蛋白质功能，从而使信号传递到下游靶标。蛋白质磷酸化是最常见的翻译后修饰之一，控制着几乎所有的细胞过程。真核生物体内的蛋白质磷酸化主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上，蛋白磷酸化受到蛋白激酶和蛋白磷酸酶的调控，而且在蛋白质底物上的磷酸化受到蛋白激酶和磷酸酶的调控，许多疾病的产生就是因为异常磷酸化和活性氧的异常增加，比如，糖尿病的产生是因为线粒体内发生氧化磷酸化。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种功能纳米通道实现监测过氧化氢和磷酸化的方法，首先将经过设计的多肽利用偶联反应接枝到纳米通道内表面，通过纳米通道内接枝对磷酸根基团具有特异性识别作用，并且对过氧化氢有响应的多肽。当多肽链遇到过氧化氢时，肽链中的半胱氨酸的巯基便会氧化形成分子内二硫键，牵引肽链的运动，进而引起流经纳米通道的离子电流增大。从另一方面，当多肽遇到磷酸化肽时，磷酸化肽分子能够诱导多肽分子发生不同程度的膨胀，进而引起离子电流的减小，因此纳米通道可以分别检测过氧化氢和磷酸化肽。激酶催化底物发生磷酸化，随着反应的进行，磷酸化肽的生成导致离子电流的不断减小，最终达到和标准磷酸化肽相同的水平，即实现了磷酸化的检测。该功能化纳米通道操作简单、成本低，无需标记，为小分子激酶抑制剂的开发提供了一个平台。
2、本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
3、本发明提出一种利用多肽修饰纳米通道监测过氧化氢和磷酸化的方法。将多肽修饰的纳米通道膜固定在电化学装置中，其中纳米通道膜允许电解质离子穿过，在施加外界电压的情况下，离子产生定向移动，并产生离子电流。当向多肽修饰的纳米通道中加入含有过氧化氢的电解质溶液，在施加外界电压的情况下，离子电流随过氧化氢浓度发生改变。另一方面，当向多肽修饰的纳米通道中加入含有磷酸化肽的电解质溶液时，在施加外界电压的情况下，离子电流随磷酸化肽浓度的变化而改变。因此多肽修饰的纳米通道可以实现对过氧化氢和磷酸化肽的监测。
4、电化学装置由两个聚四氟乙烯模块和不锈钢夹持底座以及螺丝和垫片组成。使用时用螺丝和垫片将聚四氟乙烯模块夹持聚对苯甲二酸乙二醇酯多孔膜，并固定在不锈钢底座上。
5、所述多肽修饰的纳米通道包括纳米通道膜和接枝到纳米通道内壁的多肽。
6、所述纳米通道膜为聚对苯甲二酸乙二醇酯多孔膜。
7、所述多肽为特殊设计的多肽，序列为gggceg(gpgga)4cegrrrr。
8、利用皮安计在电极两端同时施加-2v～+2v的线性扫描电压，步进电压为0.2v，间隔时间为1s，获得在不同浓度下的i-v曲线。多肽修饰的纳米通道构建方法为：将每平方厘米有1×106个离子轨道的离子辐射过的聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜两个面放在紫外灯下各照射30分钟。然后将薄膜固定在两个聚四氟乙烯模块中间，再用金属底座固定聚四氟乙烯模块。将固定有薄膜的电化学装置放在电加热台上，温度设置为40摄氏度。然后在一侧的聚四氟乙烯模块中注入9m氢氧化钠溶液，另一侧加入1m甲酸和1m氯化钾混合溶液，在两个聚四氟乙烯模块中各插入一根铂丝电极，接着用皮安计的两个接头分别连接铂丝电极，再用皮安计在电极两端同时施加1v的电压，并且检测跨膜电流，直至电流到达特定值(1×10-5a)，快速移除一侧的9m氢氧化钠溶液，换作1m甲酸和1m氯化钾的混合溶液，浸泡10分钟之后，将两侧的酸和氯化钾都吸出，加入去离子水浸泡过夜。然后在将纳米通道膜置于烧杯中，称取15mg 1-(3二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和9mg n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶于2ml去离子水中，活化纳米通道2h。然后用水清洗纳米通道膜，在将多肽溶于水中，在将纳米通道膜在室温下置于多肽的水溶液中过夜。之后用水清洗纳米通道膜，浸泡在水中备用。
9、多肽修饰的纳米通道监测磷酸化肽的步骤如下：
10、将多肽修饰后的功能纳米通道膜夹持在电化学装置之间，然后向聚四氟乙烯模具里加入少量电解质溶液，然后在电化学池的两端插入电极并用皮安计测量离子电流。多次测量电流，直至电流值稳定。
11、移除电化学池中的电解液，换成含有标准磷酸化肽的电解质溶液，然后在电化学池的两端插入电极并用皮安计测量离子电流。所述电解质溶液为0.01m nacl溶液，少量电解质溶液体积大约为2ml，电极为铂丝电极。
12、多肽修饰的纳米通道监测过氧化氢的步骤如下：
13、将多肽修饰的功能纳米通道膜夹持在电化学装置之间，然后向电化学池里加入少量电解质溶液，然后在电化学池的两端插入电极并用皮安计测量离子电流。多次测量电流，直至电流稳定。
14、移除电化学池的电解液，换成含有过氧化氢的电解质溶液，然后在电化学池的两端插入电极并用皮安计测量离子电流。所述电解质溶液为0.01m nacl溶液，少量电解质溶液体积大约为2ml，电极为铂丝电极。
15、多肽修饰的纳米通道实时监测磷酸化的步骤如下:
16、步骤一：将多肽修饰的纳米通道膜夹持在电化学装置之间，然后向电化学池中加入少量电解质溶液，然后在电化学池的两端插入电极，热水浴加热电化学装置并维持在37摄氏度左右，静置5～10分钟。用皮安计测量跨膜电流。
17、步骤二：移除电化学池中的电解质溶液，换成含有底物肽和相应激酶的反应溶液，温度继续维持在37摄氏度，插入电极并用皮安计测量跨膜电流。
18、所述步骤一里的电解质溶液为ph为7.5的50mm tris-hcl缓冲溶液、50μm的三磷酸腺苷、2mm的二硫苏糖醇、10mm氯化镁以及10mm氯化钠，电极为铂丝电极。
19、所述步骤二里的含有底物肽和相应激酶的反应溶液是将底物肽和相应激酶溶解在含有ph为7.5的50mm tris-hcl缓冲溶液、50μm的三磷酸腺苷、2mm的二硫苏糖醇、10mm氯化镁以及10mm氯化钠，电极为铂丝电极。
20、所述步骤一和步骤二里用皮安计测量跨膜电流时，电源在电极两端施加-2v～+2v的扫描电压，步进电压为+0.2v，间隔时间为1s，获得i-v曲线。
21、本发明的有益效果是：
22、(1)绿色无污染。不采用任何放射性标记方法，对环境无污染。
23、(2)效率高，检测限低。现有的荧光标记的过氧化氢检测方法效率低下。
24、(3)低成本。有机聚合物薄膜的原料成本较同位素标记法更低。
技术特征：
1.一种过氧化氢或磷酸化双响应纳米通道膜，其特征在于：
2.一种权利要求1所述纳米通道膜的制备方法，其特征在于：
3.一种权利要求1所述纳米通道膜在监测过氧化氢或磷酸化肽中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：将多肽修饰的纳米通道膜固定在h型电化学池中，其中纳米通道膜允许电解质离子穿过，在施加外界电压的情况下，离子产生定向移动，并产生离子电流；
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述磷酸化肽为蛋白激酶在多肽底物上催化的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化肽中的一种或二种以上。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
7.根据权利要求3、4或6任一所述的应用，其特征在于：利用皮安计和电极在多肽修饰的纳米通道膜两侧施加-2v～+2v的线性扫描电压，步进电压为+0.2v，间隔时间为1s，获得电流-电压(i-v)曲线。
技术总结
本发明涉及一种过氧化氢和磷酸化肽双响应纳米通道膜，此纳米通道膜能够在一个器件中既监测过氧化氢，又能对磷酸化肽进行监测。同时，针对激酶催化的磷酸化反应也有较好的响应效果。进一步将此纳米通道膜应用在监测活细胞释放的过氧化氢和磷酸化肽，也得到了较好的效果。此外本发明还涉及一种PET膜纳米孔蚀刻的制造工艺、方法/制作装置/应用等。
技术研发人员：卿光焱,彭浪,王东东
受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5