外膜囊泡、其制备方法及用途

本发明属于生物，更具体地，本发明涉及外膜囊泡的制备方法、药物组合物及其用途。

背景技术：

1、胞外囊泡(extracellular vesicle,ev)是细胞产生的以磷脂双分子层为基础的分泌性囊泡。不同细胞产生ev的途径和过程不尽相同。一些细菌，尤其革兰氏阴性细菌可以通过外膜鼓泡的形式产生外膜囊泡(outer membrane vesicle，omv)。

2、omv是细菌分泌到外环境中的一种物质，直径为50-300nm，呈现双层膜的泡状结构。omv主要含有细菌外膜的成分如磷脂、外膜蛋白、脂多糖，也可能会含有少量周质、内膜、甚至是细胞质中的成分。omv成分多变，即使是同一种细菌产生的omv，成分会伴随细菌所处环境或刺激的变化而发生变化。在不同刺激条件下，囊泡中的蛋白含量有明显差异。对于很多致病细菌而言，从其具有某些有生物活性的分子如粘附素、毒素、dna、群感分子角度而言，携带这些分子的omv对于细菌的致病力和毒力均有重要意义。从关于各种致病细菌的研究中可以发现，它们会在感染部位产生囊泡。如在慢性幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori)引起的溃疡和脑膜炎双球菌(neisseria meningitides)引起的脑膜炎患者的脑脊液和血液均有发现。被细菌感染的宿主组织细胞也能发现致病菌产生的omv，表明囊泡具有适应不同环境和长距离运输的能力。致病菌常常较非致病菌产生更多的omv，如肠道致病大肠杆菌enterotoxigenic escherichia coli(e.coli)和非致病e.coli比较，前者上清中omv含量比后者高十倍。在大肠杆菌、霍乱弧菌(vibrio cholerae)和羊种布鲁氏菌(brucella melitensis)中，细菌生长对数期末期最有可能形成omv。

3、细菌omv通常在不同胁迫条件下诱导产生。细菌所处的环境中的因素如铁离子、温度、抗生素、活性氧等都有可能影响omv的产生。例如，大肠杆菌在不含铁离子的培养条件下，omv的产量会增加。革兰氏阴性条件致病菌沙雷氏菌在22℃或是30℃的条件下能产生大量的囊泡而在37℃的条件下omv产量极低。环丙沙星、美罗培南、磷霉素和多粘菌素均会增加大肠杆菌omv的产量。此外，在铜绿假单胞菌中，噬菌体感染导致菌体裂解后，破裂的膜碎片会弯曲并复性形成囊泡。目前虽有诸多影响omv生成的环境因素被发现，然而具体的环境成分，以及细菌感应这些刺激上调或下调omv生成的调控通路大多尚不明确。

4、omv包含外膜蛋白、脂多糖及核酸等多种物质。由于其独特的结构和丰富的抗原成分，omv常常具有免疫原性。细菌omv由于产生于细菌外膜，不可避免地携带有细菌毒性蛋白、细菌免疫原性脂多糖和次级代谢物。例如细菌lps(lipopolysaccharides)是强烈的致敏原。由于lps对维持细菌膜结构完整性和生理功能必不可少，完全敲除是无法实现的，而使用去污剂处理omv减少lps含量也无法彻底实现清除，还有可能带入难以去除的去污剂。包括lps在内的细菌免疫原和毒性分子始终难以最终去除，限制了omv作为抗肿瘤药物载体的应用。

5、细菌omv作为药物递送载体开发的另一问题是靶向真核细胞的递送效率不及真核细胞来源的外泌体(exosome)。一些细菌omv的脂质成分和蛋白成分与细菌相似度较高，与真核细胞的脂质组成和蛋白成分差别较大。如包括大肠杆菌在内的大部分细菌一般不含或含较少的磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，pc)和胆固醇(cholesterol)的合成代谢途径，而真核细胞质膜富含pc与胆固醇等甾醇构成的脂筏(lipid raft)，脂质相似性与lipidraft介导的附着-吞噬是外泌体等囊泡进入靶细胞的主要途径，omv脂质组与靶细胞的差异决定了omv的靶向性不及来源于真核细胞自身的外泌体。

6、高效获取omv是开发利用这类囊泡材料的关键。为了便于区分细菌omv的制备来源，matthias等人在2017年提出了大致的分类，提议将细菌来源的omv主要区分为自发产生的omv(somv，spontaneous released omv)，使用各种去污剂刺激细菌培养物获得的omv(domv，detergent extracted omvs)，以及使用edta等非去污剂法刺激细菌培养物产生的omv(eomv)等几类。细菌自发产生的somv由于绝对量比较低，如果需要制备somv用于应用目的，需要大量发酵培养，从大量的细菌培养上清中浓缩制备获得。制备过程操作繁琐，产率极低。为了获得更多的omv，在制备上常常使用去污剂(domv)或者edta等非去污剂法(eomv)刺激细菌来获取更多的omv。相比于自发产生的omv，应用去污剂等方法获得的omv具有lps含量相对低、促进产量的优点，较多的应用于omv疫苗开发。然而这些处理过程往往造成细菌的裂解死亡和次级代谢物、dna、蛋白质等内容物的释放，后续需要使用dna酶降解去掉dna杂质，并结合透析和柱色谱等多种方法去除去污剂等试剂以及细菌裂解释放的杂质，使纯化omv变得更加复杂繁琐和高成本。更重要的是，这些处理步骤不可避免的对omv原有的生物活性造成影响，尤其是去污剂的引入除了可能破坏omv磷脂双分子层结构和性质，影响omv装载蛋白的活性以外，其本身较难被彻底去除。此外，虽然经过诱导处理，由于目前技术获得的omv在发酵原液中的原始产量仍然普遍偏低，需要先进行高成本、长耗时的预浓缩处理，常用的盐析浓缩易造成omv及其装载物质性能的损害，而膜渗透浓缩成本高昂且不利于杂质去除。

7、细菌omv目前产量仍然偏低，且始终难以彻底清除残留的细菌致敏原和毒性蛋白、副产物的问题，加上细菌omv在脂质组、蛋白组上与真核靶细胞的差异，与真核靶细胞融合递送效率不及外泌体等诸多原因，使得目前omv的应用受限制。omv作为药物递送载体的最终应用，需要在改进omv性能以降低体内毒性和免疫原性，以及提高omv靶向真核细胞效率，改进omv产量和纯化工艺这三个方面取得有效突破。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供外膜囊泡的制备方法、其组合物、药物组合物及其用途。

2、在本发明的第一方面，提供一种外膜囊泡(omv)的制备方法，包括以下步骤：(i)用培养基培养吸血昆虫来源的肠道细菌，以使得该细菌将囊泡释放入所述培养基；和(ii)收集所述培养基中的囊泡。

3、在一种或多种实施方式中，所述制备方法中，包括以含血清物诱导的步骤；较佳地，所述含血清物包括(但不限于)：血清、血浆(全血)、血清提取物或血清替代物；较佳地，所述的含血清物来源于小鼠、大鼠、人、牛、猪、兔、羊、马。

4、在一种或多种实施方式中，所述吸血昆虫来源的肠道细菌包括按蚊或伊蚊来源的肠道细菌。

5、在一种或多种实施方式中，所述肠道细菌包括沙雷氏菌。

6、在一种或多种实施方式中，所述的肠道细菌包括：解脲沙雷氏菌(serratiaureilytica)，粘质沙雷菌(serratia marcescens)，深红沙雷氏菌(serratia rubidaea)，液化沙雷氏菌(serratia liquefaciens)，普城沙雷菌(serratia plymuthica)，无花果沙雷氏菌(serratia ficaria)，格氏沙雷氏菌(serratia grimesii)，居泉沙雷氏菌(serratia fonticola)等。

7、在一种或多种实施方式中，所述的肠道细菌是su_yn1，其为保藏号cgmccno.18971的菌株。

8、在一种或多种实施方式中，所述血清为牛血清，所述牛血清包括但不限于：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、成牛血清；优选的，所述的血清是胎牛血清(fbs)。

9、在一种或多种实施方式中，所述制备方法包括如下的a-g中的一个或多个：

10、a.步骤(i)中所述培养基培养细菌的培养温度为15～33℃，优选为18～32℃，更优选为20～30℃(如22、24、26、28℃)；

11、b.步骤(i)中所述的细菌接种比例为种子液：培养液＝1：100，其中，种子液细菌od值为1.0od～3.0od，优选为2.0od～3.0od；

12、c.步骤(i)中所述培养基培养细菌的培养时间为10～80小时，优选为12～60小时，更优选为15～48小时(如18～24小时、20～24小时、21～24小时等)；

13、d.所述血清的浓度为3～20％，优选5～15％，更优选8～12％；

14、e.所述收集囊泡的方式是通过过滤、离心、或盐析的方式收集囊泡；优选的，所述过滤使用滤器过滤，和/或，所述离心为4℃低温离心；更优选，所述过滤使用0.2μm的滤器过滤；和/或，所述离心为超速离心，离心力10000g-25000g，最优选离心力为15000g。

15、在一种或多种实施方式中，所述制备方法不包括预浓缩的步骤，优选不包括使用超滤浓缩或去污剂沉淀浓缩的步骤，更优选的所述去污剂是三氯乙酸(tca)。

16、在一种或多种实施方式中，所述制备方法无需经过透析或梯度纯化。

17、在一种或多种实施方式中，所述制备方法还包括通过脂质组聚类分析进行脂质成分的检测和/或鉴定的步骤。

18、在一种或多种实施方式中，所述制备方法还包括定量步骤，优选所述定量步骤是通过基于总蛋白的bca定量方法，和/或基于lps含量的kdo定量方法，和/或基于总脂类含量的定量方法进行定量检测。

19、在一种或多种实施方式中，所述制备方法还包括采用nta颗粒分析仪进行直观的颗粒分析的步骤。

20、在本发明的第二方面，提供一种分离的外膜囊泡(omv)，其特征在于，其是通过本发明所述的制备方法制备获得的。

21、在一种或多种实施方式中，所述外膜囊泡具有选自下组的特征：

22、颗粒均匀，平均粒径100-150nm；

23、具有亲近真核特性的脂质组成；较佳地，所述脂质包括(但不限于)：磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，甘油磷脂；较佳地，所述脂质不以甘油磷脂(含量低于10％)、lps脂多糖(含量低于1％)为主；

24、具有来自于血清(载脂蛋白和铁结合蛋白等)和吸血昆虫来源的肠道细菌(autotransporter等外膜来源的蛋白)的蛋白组成；

25、具有低lps脂多糖比例；较佳地，以kdo方法计，lps量低于0.5μg/100μg omv，更佳地低于0.4μg/100μg omv。

26、在本发明的第三方面，提供一种组合物，其包含本发明所述的外膜囊泡；优选的，所述组合物不包含任何活细菌和/或完整细菌。

27、在本发明的第四方面，提供一种药物组合物，其包含：本发明所述的分离的外膜囊泡(omv)；整合或装载于所述外膜囊泡的治疗剂和/或诊断剂；和药学上可接受的载体或赋形剂。

28、在一种或多种实施方式中，所述治疗剂包括：抗肿瘤药、抗感染剂、抗过敏剂、抗贫血药、血管生成抑制剂、β-肾上腺素能阻断剂、钙通道拮抗剂、抗高血压药、抗抑郁剂、抗惊厥药、抗细菌药、抗真菌药、抗病毒药、抗风湿药、抗寄生虫药、抗疟药物、激素、激素拮抗药、免疫调节剂、神经递质拮抗剂、抗糖尿病药、抗癫病药、抗出血药、抗高渗药、抗青光眼药、免疫调节细胞因子、镇静药、趋化因子、维生素、毒素、麻醉品、成像剂及其组合；

29、优选的，所述治疗剂是治疗肝期疟原虫及其休眠子的抗疟药物，特别是治疗肝期疟原虫及其休眠子寄生虫血症的抗疟药物；

30、更优选的，所述抗疟药物包括青蒿素类抗疟药和氨基喹啉类抗疟药；

31、最优选的，所述青蒿素类抗疟药包括青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢青蒿素或蒿乙醚，所述氨基喹啉类抗疟药包括氯喹、磷酸氯喹、哌喹、伯氨喹或磷酸伯氨喹；较佳的，所述抗疟药物是伯氨喹；

32、和/或，

33、所述诊断剂包括：成像剂、免疫调节剂、抗原、佐剂、细胞因子、趋化因子、抗癌剂、抗感染剂、核酸、抗体或其片段、融合蛋白质；优选的，所述诊断剂是诊断肝期疟原虫及其休眠子相关的疟疾的试剂；更优选的，所述诊断剂是诊断肝期疟原虫及其休眠子相关的寄生虫血症的试剂。

34、在本发明的第五方面，提供一种复合物，其特征在于，所述复合物包含本发明所述的分离的外膜囊泡(omv)和脂肪水解酶；

35、优选的，所述脂肪水解酶是amlip，或其片段、衍生物和类似物，

36、更优选的，所述amlip包括氨基酸序列如seq id no:2所示的蛋白；或，氨基酸序列与seq id no:2具有90％以上序列同一性且具有seq id no:2所示的蛋白的功能的衍生蛋白。

37、在本发明的第六方面，提供本发明所述的分离的外膜囊泡(omv)、本发明所述的组合物、本发明所述的药物组合物或本发明所述的复合物在制备用于预防、治疗疾病的药物中的应用；较佳的，其中所述预防疾病的药物是疫苗。

38、在一种或多种实施方式中，其中所述疾病包括肿瘤、感染、过敏、贫血、高血压、抑郁、惊厥、细菌感染、真菌感染、病毒感染、风湿病、寄生虫、疟疾、免疫系统疾病、神经系统疾病、糖尿病、癫痫、出血、高渗、青光眼、镇静、毒素、麻醉。

39、在一种或多种实施方式中，所述疾病是疟疾，特别是疟原虫及其休眠子相关的疟疾。

40、在一种或多种实施方式中，所述疾病是肝期疟原虫及其休眠子相关的疟疾，特别是肝期疟原虫及其休眠子相关的寄生虫血症。

41、在本发明的第七方面，提供本发明所述的外膜囊泡、本发明所述的组合物或本发明所述的复合物在制备用于装载和/或递送预防、治疗疾病的药物的产品中的应用；较佳的，其中所述产品是疫苗。

42、在一种或多种实施方式中，其中所述疾病包括肿瘤、感染、过敏、贫血、高血压、抑郁、惊厥、细菌感染、真菌感染、病毒感染、风湿病、寄生虫、疟疾、免疫系统疾病、神经系统疾病、糖尿病、癫痫、出血、高渗、青光眼、镇静、毒素、麻醉。

43、在一种或多种实施方式中，所述疾病是疟疾，特别是疟原虫及其休眠子相关的疟疾。

44、在一种或多种实施方式中，所述疾病是肝期疟原虫及其休眠子相关的疟疾，特别是肝期疟原虫及其休眠子相关的寄生虫血症。

45、在一种或多种实施方式中，所述的疟原虫为以疟原虫易感昆虫、啮齿类动物、灵长类动物、禽类或鸟类为宿主的疟原虫；较佳地包括：恶性疟原虫(plasmodium falciparum)，伯氏疟原虫(plasmodium berghei)，三日疟原虫(plasmodium malariae)，卵型疟原虫(plasmodium ovale)，间日疟原虫(plasmodium vivax)，巴西疟原虫(plasmodiumbrasilianum)，食蟹猴疟原虫(plasmodium cynomolgi)，诺氏疟原虫(plasmodiumknowlesi)，许氏疟原虫(plasmodium schwetzi)，猿疟原虫(plasmodium simium)，夏氏疟原虫(plasmodium chabaudi)，约氏疟原虫(plasmodium yoelii)，鸡疟原虫(plasmodiumgallinaceum)，残疟原虫(plasmodium relictum)。

46、在一种或多种实施方式中，所述的疟原虫为以疟原虫易感性蚊虫为宿主的疟原虫；优选的，所述疟原虫易感性蚊虫包括：按蚊，伊蚊。

47、在本发明的第八方面，提供一种抑制疟原虫的方法，包括：利用本发明所述的分离的外膜囊泡(omv)、本发明所述的组合物或本发明所述的复合物递送抑制疟原虫的药物，或利用本发明所述的药物组合物进行抑制。

48、在本发明的第九方面，提供一种用于抑制疟原虫或防治疟原虫感染相关疾病的试剂盒/药盒，其包含：本发明所述的分离的外膜囊泡；本发明所述的组合物；本发明所述的药物组合物；或本发明所述的复合物，或其组合。

49、在本发明的第十方面，提供一种吸血昆虫来源的肠道细菌或其培养物的用途，用于制备外膜囊泡(omv)；优选的，所述吸血昆虫来源的肠道细菌包括按蚊或伊蚊来源的肠道细菌；更优选地，肠道细菌包括沙雷氏菌。

50、在一种或多种实施方式中，，所述的肠道细菌包括：解脲沙雷氏菌(serratiaureilytica)，粘质沙雷菌(serratia marcescens)，深红沙雷氏菌(serratia rubidaea)，液化沙雷氏菌(serratia liquefaciens)，普城沙雷菌(serratia plymuthica)，无花果沙雷氏菌(serratia ficaria)，格氏沙雷氏菌(serratia grimesii)，居泉沙雷氏菌(serratia fonticola)等。

51、在一种或多种实施方式中，所述的肠道细菌是su_yn1，其为保藏号cgmccno.18971的菌株。

52、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

技术特征：

1.一种外膜囊泡(omv)的制备方法，包括以下步骤：(i)用培养基培养吸血昆虫来源的肠道细菌，以使得该细菌将囊泡释放入所述培养基；和(ii)收集所述培养基中的囊泡。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，包括以含血清物诱导的步骤；较佳地，所述含血清物包括：血清、血浆、血清提取物或血清替代物；较佳地，所述的含血清物来源于小鼠、大鼠、人、牛、猪、兔、羊、马。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述吸血昆虫来源的肠道细菌包括按蚊或伊蚊来源的肠道细菌；较佳地，所述的肠道细菌包括沙雷氏菌；较佳地，所述的肠道细菌包括：解脲沙雷氏菌(serratia ureilytica)，粘质沙雷菌(serratia marcescens)，深红沙雷氏菌(serratia rubidaea)，液化沙雷氏菌(serratia liquefaciens)，普城沙雷菌(serratia plymuthica)，无花果沙雷氏菌(serratia ficaria)，格氏沙雷氏菌(serratiagrimesii)，居泉沙雷氏菌(serratia fonticola)等；更佳地，所述的肠道细菌是su_yn1，其为保藏号cgmccno.18971的菌株。

4.如权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下的a-g中的一个或多个：

5.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法不包括预浓缩的步骤，优选不包括使用超滤浓缩或去污剂沉淀浓缩的步骤，更优选的所述去污剂是三氯乙酸(tca)；

6.一种分离的外膜囊泡(omv)，其特征在于，其是通过权利要求1-5任一项所述的制备方法制备获得的。

7.如权利要求6所述的分离的外膜囊泡(omv)，其特征在于，所述外膜囊泡具有选自下组的特征：

8.一种组合物，其包含如权利要求6或7所述的外膜囊泡；较佳地所述组合物不包含任何活细菌和/或完整细菌。

9.一种药物组合物，其包含：

10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述治疗剂包括：抗肿瘤药、抗感染剂、抗过敏剂、抗贫血药、血管生成抑制剂、β-肾上腺素能阻断剂、钙通道拮抗剂、抗高血压药、抗抑郁剂、抗惊厥药、抗细菌药、抗真菌药、抗病毒药、抗风湿药、抗寄生虫药、抗疟药物、激素、激素拮抗药、免疫调节剂、神经递质拮抗剂、抗糖尿病药、抗癫病药、抗出血药、抗高渗药、抗青光眼药、免疫调节细胞因子、镇静药、趋化因子、维生素、毒素、麻醉品、成像剂及其组合；

11.一种复合物，其特征在于，所述复合物包含权利要求6或7所述的分离的外膜囊泡(omv)和脂肪水解酶；

12.权利要求6或7所述的分离的外膜囊泡(omv)、权利要求8所述的组合物、权利要求9或10所述的药物组合物或权利要求11所述的复合物在制备用于预防、治疗疾病的药物中的应用；较佳的，其中所述预防疾病的药物是疫苗；

13.权利要求6或7所述的外膜囊泡、权利要求8所述的组合物或权利要求11所述的复合物在制备用于装载和/或递送预防、治疗疾病的药物的产品中的应用；较佳的，其中所述产品是疫苗；

14.如权利要求12或13所述的应用，其特征在于，所述的疟原虫为以疟原虫易感昆虫、啮齿类动物、灵长类动物、禽类或鸟类为宿主的疟原虫；较佳地包括：恶性疟原虫(plasmodium falciparum)，伯氏疟原虫(plasmodium berghei)，三日疟原虫(plasmodiummalariae)，卵型疟原虫(plasmodium ovale)，间日疟原虫(plasmodiumvivax)，巴西疟原虫(plasmodium brasilianum)，食蟹猴疟原虫(plasmodium cynomolgi)，诺氏疟原虫(plasmodium knowlesi)，许氏疟原虫(plasmodium schwetzi)，猿疟原虫(plasmodium simium)，夏氏疟原虫(plasmodium chabaudi)，约氏疟原虫(plasmodiumyoelii)，鸡疟原虫(plasmodium gallinaceum)，残疟原虫(plasmodium relictum)；

15.一种抑制疟原虫的方法，包括：利用权利要求6或7所述的分离的外膜囊泡(omv)、权利要求8所述的组合物或权利要求11所述的复合物递送抑制疟原虫的药物，或利用权利要求9或10所述的药物组合物进行抑制。

16.一种用于抑制疟原虫或防治疟原虫感染相关疾病的试剂盒/药盒，其包含：权利要求6或7所述的分离的外膜囊泡；权利要求8所述的组合物；权利要求9或10所述的药物组合物；或权利要求11所述的复合物，或其组合。

17.一种吸血昆虫来源的肠道细菌或其培养物的用途，用于制备外膜囊泡(omv)；优选的，所述吸血昆虫来源的肠道细菌包括按蚊或伊蚊来源的肠道细菌；较佳地，肠道细菌包括沙雷氏菌；较佳地，所述的肠道细菌包括：解脲沙雷氏菌(serratia ureilytica)，粘质沙雷菌(serratia marcescens)，深红沙雷氏菌(serratia rubidaea)，液化沙雷氏菌(serratialiquefaciens)，普城沙雷菌(serratia plymuthica)，无花果沙雷氏菌(serratiaficaria)，格氏沙雷氏菌(serratia grimesii)，居泉沙雷氏菌(serratia fonticola)等；更佳地，所述的肠道细菌是su_yn1，其为保藏号cgmcc no.18971的菌株。

技术总结
本发明提供了一种制备外膜囊泡(OMV)的方法，还提供了通过所述方法制备获得的外膜囊泡(OMV)、其组合物及其在制备用于预防疾病(如制备成疫苗)、治疗疾病(如肝期疟原虫及其休眠子相关的疟疾)的药物中的应用。

技术研发人员：王四宝,高涵
受保护的技术使用者：中国科学院分子植物科学卓越创新中心
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5