一种金属蛋白酶激活型CAR-T结构的制备及其应用

本发明涉及基因工程及分子免疫学，具体涉及一种金属蛋白酶激活型car-t结构的制备及其应用。

背景技术：

1、肿瘤细胞可因表面抗原缺失/调变、主要组织相容性复合体(mhc)i类分子缺失或表达减少等躲避t细胞的识别和攻击，产生免疫逃逸。嵌合抗原受体t细胞，即car-t，是一种经基因工程改造后特异性识别并杀伤肿瘤细胞的新型细胞治疗产品，其介导的抗原识别不受mhc限制，已成为最具有潜力的恶性肿瘤治疗手段之一。经典的car结构包括一个肿瘤相关抗原结合区，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。

2、靶向cd19、cd22的car-t细胞已广泛应用于b细胞急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤等血液系统肿瘤的治疗，并取得了显著疗效。近年来，越来越多的car-t细胞产品被开发出来，用于恶性实体肿瘤治疗，部分已经进入临床试验阶段。尽管car-t细胞治疗已经成为最有前景的生物治疗手段，但car-t治疗的毒副作用，如car分子的脱靶效应、细胞因子释放综合征、car-t相关脑病综合征等仍未解决。因此，在提高car-t疗效的同时，进一步提高car-t细胞产品的安全性也至关重要。

3、目前car-t细胞作用的靶点大多为肿瘤相关抗原而非肿瘤特异性抗原，导致car-t在杀伤肿瘤细胞的同时，会不可避免的杀伤表达相同靶点抗原的正常组织细胞(即脱靶效应)，引起正常组织器官受损或衰竭，严重者可有生命危险。当前针对脱靶效应的策略有两种，一种是根据正常组织器官和恶性肿瘤细胞表面抗原表达量的差异，选择与靶点抗原具有不同亲和力的单链抗体；另一种是引入同时识别两/多种抗原或缺乏特定抗原的“逻辑门控”car分子，以优化car对肿瘤细胞的识别。然而以上两种策略依然存在局限性。

4、因此，本领域迫切需要研发一种针对脱靶效应的新策略，开发一种毒副作用更低、安全性更高的工程化免疫细胞产品。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供一种条件激活型嵌合抗原受体(car)及工程化免疫细胞。

2、本发明的另一目的在于提供条件激活型嵌合抗原受体(car)及工程化免疫细胞的制备方法及应用。

3、本发明的又一目的在于提供一种不易脱靶、毒副作用更低、安全性更高的免疫疗法。

4、在本发明的第一方面，提供了一种条件激活型嵌合抗原受体(car)，所述条件激活型嵌合抗原受体包括：

5、(i)包含tsar调控元件和抗原识别结构域的胞外结构域；

6、(ii)连接至所述胞外结构域的跨膜结构域；和

7、(iii)连接至所述跨膜结构域的胞内结构域；

8、其中：

9、所述tsar调控元件包括：血清白蛋白结合肽和基质金属蛋白酶切割序列；

10、所述抗原识别结构域靶向肿瘤抗原。

11、在另一优选例中，所述tsar调控元件具有选自下组的核苷酸序列：

12、(a)与seq id no:1所示序列具有80％及以上同源性的核苷酸序列(优选地具有至少85％、90％、95％、99％或100％同源性)；或

13、(b)在seq id no:1所示序列的基础上经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个核苷酸所获得的核苷酸序列。

14、在另一优选例中，所述tsar调控元件具有如seq id no:1所示的核苷酸序列。

15、在另一优选例中，所述tsar调控元件具有选自下组的氨基酸序列：

16、(a)与seq id no:2所示序列具有80％及以上同源性的氨基酸序列(优选地具有至少85％、90％、95％、99％或100％同源性)；或

17、(b)在seq id no:2所示序列的基础上经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸所获得的氨基酸序列。

18、在另一优选例中，所述tsar调控元件具有如seq id no:2所示的氨基酸序列。

19、在另一优选例中，所述血清白蛋白结合肽为人血清白蛋白结合肽。

20、在另一优选例中，所述血清白蛋白结合肽具有选自下组的核苷酸序列：

21、(a)与seq id no:3所示序列具有80％及以上同源性的核苷酸序列(优选地具有至少85％、90％、95％、99％或100％同源性)；或

22、(b)在seq id no:3所示序列的基础上经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个核苷酸所获得的核苷酸序列。

23、在另一优选例中，所述血清白蛋白结合肽具有如seq id no:3所示的核苷酸序列。

24、在另一优选例中，所述血清白蛋白结合肽具有选自下组的氨基酸序列：

25、(a)与seq id no:4所示序列具有80％及以上同源性的氨基酸序列(优选地具有至少85％、90％、95％、99％或100％同源性)；或

26、(b)在seq id no:4所示序列的基础上经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸所获得的氨基酸序列。

27、在另一优选例中，所述血清白蛋白结合肽具有如seq id no:4所示的氨基酸序列。

28、在另一优选例中，所述基质金属蛋白酶切割序列为人基质金属蛋白酶切割序列。

29、在另一优选例中，所述基质金属蛋白酶切割序列具有选自下组的核苷酸序列：

30、(a)与seq id no:5所示序列具有80％及以上同源性的核苷酸序列(优选地具有至少85％、90％、95％、99％或100％同源性)；或

31、(b)在seq id no:5所示序列的基础上经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个核苷酸所获得的核苷酸序列。

32、在另一优选例中，所述基质金属蛋白酶切割序列具有如seq id no:5所示的核苷酸序列。

33、在另一优选例中，所述基质金属蛋白酶切割序列具有选自下组的氨基酸序列：

34、(a)与seq id no:6所示序列具有80％及以上同源性的氨基酸序列(优选地具有至少85％、90％、95％、99％或100％同源性)；或

35、(b)在seq id no:6所示序列的基础上经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸所获得的氨基酸序列。

36、在另一优选例中，所述基质金属蛋白酶切割序列具有如seq id no:6所示的氨基酸序列。

37、在另一优选例中，所述基质金属蛋白酶切割序列为基质金属蛋白酶(mmp)识别并切割的位点。

38、在另一优选例中，所述基质金属蛋白酶选自下组：mmp1、mmp2、mmp3、mmp4、mmp5、mmp6、mmp7、mmp8、mmp9、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp14、mmp15、mmp16、mmp17、mmp18、mmp19、mmp20、mmp21、mmp22、mmp23、mmp24、mmp25、mmp26，或其组合。

39、在另一优选例中，所述基质金属蛋白酶选自下组：mmp1、mmp3、mmp10、mmp12、mmp13，或其组合。

40、在另一优选例中，所述基质金属蛋白酶为mmp1。

41、在另一优选例中，所述条件激活型嵌合抗原受体具有选自下组的氨基酸序列：

42、(a)与seq id no:8所示序列具有80％及以上同源性的氨基酸序列(优选地具有至少85％、90％、95％、99％或100％同源性)；或

43、(b)在seq id no:8所示序列的基础上经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸所获得的氨基酸序列。

44、在另一优选例中，所述条件激活型嵌合抗原受体具有如seq id no:8所示的氨基酸序列。

45、在另一优选例中，所述肿瘤抗原包括但不限于下组：

46、b7-h3、vegfr-2、cd19、cd20、cd30、cd22、cd25、cd28、cd30、cd33、cd52、cd56、cd80、cd86、cd81、cd123、cd171、cd276、b7h4、cd133、egfr、gpc3、pmsa、cd3、ceacam6、c-met、egfrviii、erbb2、erbb3 her-2、her3、erbb4/her-4、epha2、igf1r、gd2、o-acetyl gd2、o-acetyl gd3、ghrhr、ghr、flt1、kdr、flt4、cd44v6、cea、ca125、cd151、ctla-4、gitr、btla、tgfbr2、tgfbr1、il6r，gp130、lewis、tnfr1、tnfr2、pd1、pd-l1、pd-l2，hvem、mage-a、mesothelin、ny-eso-1、psma、rank、rorl、tnfrsf4、cd40、cd137、tweak-r、ltpr、lifrp、lrp5、muc1、tcra、tcrp、tlr7、tlr9、ptch1、wt-1、robol、frizzled、ox40、cd79b、notch-1-4，或其组合。

47、在另一优选例中，所述肿瘤抗原为b7-h3。

48、在另一优选例中，所述肿瘤包括但不限于下组：

49、食管恶性肿瘤、肺恶性肿瘤、胃恶性肿瘤、皮肤恶性肿瘤、结直肠恶性肿瘤、肝恶性肿瘤、胰腺恶性肿瘤、乳腺恶性肿瘤、卵巢恶性肿瘤、胶质瘤、头颈部肿瘤，或其组合。

50、在另一优选例中，所述肿瘤为食管恶性肿瘤(食管癌)。

51、在另一优选例中，所述肿瘤为胃癌。

52、在另一优选例中，所述肿瘤为结直肠癌。

53、在另一优选例中，所述肿瘤为肝癌。

54、在另一优选例中，所述肿瘤为胰腺癌。

55、在另一优选例中，所述肿瘤为黑色素瘤。

56、在另一优选例中，所述肿瘤为肺癌。

57、在另一优选例中，所述肿瘤为卵巢癌。

58、在另一优选例中，所述肿瘤为乳腺癌。

59、在另一优选例中，所述肿瘤为胶质瘤。

60、在另一优选例中，所述肿瘤为甲状腺癌。

61、在另一优选例中，所述肿瘤为膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌，或皮肤癌。

62、在另一优选例中，所述肿瘤包括：弥漫性大b细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、脑低级别胶质瘤、肺鳞状细胞癌、胃腺癌、睾丸生殖细胞肿瘤、胸腺瘤、子宫癌肉瘤，或其组合。

63、在另一优选例中，所述条件激活型嵌合抗原受体具有式i所示结构：

64、sp-tsar-binder-h-tm-c-cd3ζ(i)

65、式中，

66、sp为无或信号肽序列；

67、tsar为tsar调控元件；

68、binder为特异性结合肿瘤抗原的抗原识别结构域；

69、h为无或铰链区；

70、tm为跨膜结构域；

71、c为共刺激信号结构域；

72、cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列(包括野生型或其突变体/修饰体)；

73、所述“-”为连接肽或肽键。

74、在另一优选例中，所述sp选自下组蛋白的信号肽：cd8、gm-csf、cd4、cd28、cd137，或其突变/修饰体，或其组合。

75、在另一优选例中，所述binder为b7-h3单链抗体(b7-h3 scfv)。

76、在另一优选例中，所述h选自下组蛋白的铰链区：cd8、cd28、cd137、igg，或其组合。

77、在另一优选例中，所述h为cd8铰链区。

78、在另一优选例中，所述tm选自下组蛋白的跨膜区：cd28、cd3 epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、cd278、cd152、cd279、cd233，或其突变/修饰体，或其组合。

79、在另一优选例中，所述tm为cd8跨膜区。

80、在另一优选例中，所述c选自下组蛋白的共刺激信号结构域：ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd-1、dap10、light、nkg2c、b7-h3、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、ox40l、2b4、tlr，或其突变/修饰体，或其组合。

81、在另一优选例中，所述c为cd137(4-1bb)共刺激信号结构域、cd28共刺激信号结构域，或其组合。

82、在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如本发明第一方面所述的条件激活型嵌合抗原受体。

83、在另一优选例中，所述核酸分子具有选自下组的核苷酸序列：

84、(a)与seq id no:7所示序列具有80％及以上同源性的核苷酸序列(优选地具有至少85％、90％、95％、99％或100％同源性)；或

85、(b)在seq id no:7所示序列的基础上经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个核苷酸所获得的核苷酸序列。

86、在另一优选例中，所述核酸分子具有如seq id no:7所示的核苷酸序列。

87、在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第二方面所述的核酸分子。

88、在另一优选例中，所述载体选自下组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子，或其组合。

89、在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

90、在另一优选例中，所述载体选自下组：ptomo慢病毒载体、plenti、plvth、pljm1、phcmv、plbs.cag、phr、plv等。

91、在另一优选例中，所述载体中还包括选自下组的：启动子、转录增强元件wpre、长末端重复序列ltr等。

92、在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第三方面所述的载体，或其染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的核酸分子，或其表达如本发明第一方面所述的条件激活型嵌合抗原受体。

93、在本发明的第五方面，提供了一种工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞含有如本发明第三方面所述的载体，或其染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的核酸分子，或其表达如本发明第一方面所述的条件激活型嵌合抗原受体，并且所述工程化免疫细胞为t细胞、nk细胞、nkt细胞，或巨噬细胞。

94、在另一优选例中，所述工程化免疫细胞包括自体或异体的αβt细胞、γδt细胞、nkt细胞、nk细胞，或其组合。

95、在另一优选例中，所述工程化免疫细胞为car-t细胞或car-nk细胞。

96、在本发明的第六方面，提供了一种制备如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞的方法，所述方法包括以下步骤：将如本发明第二方面所述的核酸分子或如本发明第三方面所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

97、在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

98、在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：

99、(z1)如本发明第一方面所述的条件激活型嵌合抗原受体、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞、如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞，或其组合；和

100、(z2)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

101、在另一优选例中，所述药物组合物为液态制剂。

102、在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。

103、在另一优选例中，所述药物组合物中所述工程化免疫细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×104-1×107个细胞/ml。

104、在本发明的第八方面，提供了一种如本发明第一方面所述的条件激活型嵌合抗原受体、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞，和/或如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

105、在另一优选例中，所述肿瘤为高表达基质金属蛋白酶的肿瘤。

106、在另一优选例中，所述肿瘤包括但不限于下组：

107、食管恶性肿瘤、肺恶性肿瘤、胃恶性肿瘤、皮肤恶性肿瘤、结直肠恶性肿瘤、肝恶性肿瘤、胰腺恶性肿瘤、乳腺恶性肿瘤、卵巢恶性肿瘤、胶质瘤、头颈部肿瘤，或其组合。

108、在另一优选例中，所述肿瘤为食管恶性肿瘤(食管癌)。

109、在另一优选例中，所述肿瘤为胃癌。

110、在另一优选例中，所述肿瘤为结直肠癌。

111、在另一优选例中，所述肿瘤为肝癌。

112、在另一优选例中，所述肿瘤为胰腺癌。

113、在另一优选例中，所述肿瘤为黑色素瘤。

114、在另一优选例中，所述肿瘤为肺癌。

115、在另一优选例中，所述肿瘤为卵巢癌。

116、在另一优选例中，所述肿瘤为乳腺癌。

117、在另一优选例中，所述肿瘤为胶质瘤。

118、在另一优选例中，所述肿瘤为甲状腺癌。

119、在另一优选例中，所述肿瘤为膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌，或皮肤癌。

120、在另一优选例中，所述肿瘤包括：弥漫性大b细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、脑低级别胶质瘤、肺鳞状细胞癌、胃腺癌、睾丸生殖细胞肿瘤、胸腺瘤、子宫癌肉瘤，或其组合。

121、在本发明的第九方面，提供了一种如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第七方面所述的药物组合物的用途，用于预防和/或治疗癌症或肿瘤。

122、在本发明的第十方面，提供了一种改造嵌合抗原受体(car)的方法，所述方法包括步骤：

123、(a)提供一待改造的嵌合抗原受体；和

124、(b)在待改造的嵌合抗原受体的抗原识别结构域前导入tsar调控元件，从而获得安全性更高的条件激活型嵌合抗原受体。

125、在本发明的第十一方面，提供了一种用于制备如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的如本发明第二方面所述的核酸分子，或如本发明第三方面所述的载体。

126、在本发明的第十二方面，提供了一种治疗癌症或肿瘤的方法，包括给需要治疗的对象施用有效量的如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第七面所述的药物组合物。

127、在另一优选例中，所述工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的car免疫细胞是来源于所述对象的细胞(自体细胞)。

128、在另一优选例中，所述工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的car免疫细胞是来源于健康个体的细胞(异体细胞)。

129、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

技术特征：

1.一种条件激活型嵌合抗原受体(car)，其特征在于，所述条件激活型嵌合抗原受体包括：

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述的条件激活型嵌合抗原受体。

3.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求2所述的核酸分子。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求3所述的载体，或其染色体中整合有外源的如权利要求2所述的核酸分子，或其表达如权利要求1所述的条件激活型嵌合抗原受体。

5.一种工程化免疫细胞，其特征在于，所述工程化免疫细胞含有如权利要求3所述的载体，或其染色体中整合有外源的如权利要求2所述的核酸分子，或其表达如权利要求1所述的条件激活型嵌合抗原受体，并且所述工程化免疫细胞为t细胞、nk细胞、nkt细胞，或巨噬细胞。

6.一种制备如权利要求5所述的工程化免疫细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将如权利要求2所述的核酸分子或如权利要求3所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：

8.一种如权利要求1所述的条件激活型嵌合抗原受体、如权利要求2所述的核酸分子、如权利要求3所述的载体、如权利要求4所述的宿主细胞，和/或如权利要求5所述的工程化免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

9.一种改造嵌合抗原受体(car)的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

10.一种用于制备如权利要求5所述的工程化免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的如权利要求2所述的核酸分子，或如权利要求3所述的载体。

技术总结
本发明提供了一种金属蛋白酶激活型CAR‑T结构的制备及其应用。具体地，本发明提供了一种包含TSAR调控元件的条件激活型嵌合抗原受体、工程化免疫细胞及其制法与应用。利用肿瘤微环境基质金属蛋白酶高表达的特点，基于条件性激活的工程化免疫细胞产品可实现不易脱靶、毒副作用更低、安全性更高的免疫疗法。

技术研发人员：程振国,王尧河,王丽虹
受保护的技术使用者：郑州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5