HLA-G特异性抗体及其用途的制作方法

本发明涉及一种特异性结合人白细胞抗原-g(hla-g)的抗体及其在癌症治疗中的用途。

背景技术：

1、尽管过去几十年来人们已经对癌症进行了深入的研究，但癌症仍然是世界范围内的一个主要死亡原因。已经开发了许多癌症治疗方法，诸如手术、化疗和放疗等方法至今仍在使用。然而，这些现有的癌症治疗方法大多仅在癌症尚未转移的早期阶段有效，并且存在当已经发生转移时即使在手术后也有很大可能复发的问题。因此，为了更有效地治疗癌症，对利用免疫反应的免疫疗法的研究一直在持续进行。

2、免疫疗法是一种防止癌细胞逃避人体的免疫系统，从而使得免疫细胞更好地识别和攻击癌细胞的治疗方法。具体地，免疫疗法可通过非特异性免疫细胞激活来诱导癌细胞的死亡，或使用肿瘤特异性抗原在癌症患者的免疫细胞中诱导针对肿瘤的免疫反应。

3、同时，人主要组织相容性复合体i类g，也称为人白细胞抗原-g(hla-g)，是抑制t细胞、自然杀伤(nk)细胞和细胞毒性t细胞的激活和分裂的免疫检查点。hla-g的已知免疫细胞受体包括ig样转录物2(ilt2)、ilt4和杀伤细胞免疫球蛋白样受体两个ig结构域和长胞质尾4(kir2dl4)，并且所有这些受体都具有免疫受体酪氨酸抑制性(itim)基序。当hla-g与受体结合时，抑制免疫细胞的信号通路被该基序激活。

4、虽然hla-g的表达仅限于正常细胞，但已有报道称，hla-g在许多类型的癌细胞中表达(lin a、yan wh.human leukocyte antigen-g(hla-g)expression in cancers:rolesin immune evasion,metastasis and target for therapy.mol med.21(1),782-791(2015))。此外，已有报道称，许多癌症患者的癌细胞中的hla-g表达水平与癌症的分期有关，还有报道称，表达hla-g的患者生存率较低(ye,sr.、yang,h.、li,k.等人humanleukocyte antigen g expression:as a significant prognostic indicator forpatients with colorectal cancer.mod pathol 20,375-383(2007))。

技术实现思路

1、技术问题

2、在以上情况下，本发明人尝试了开发人白细胞抗原-g(hla-g)特异性抗体，以通过抑制hla-g的功能来增加免疫细胞对癌细胞的靶向能力。因此，本发明人开发了一种能够结合hla-g单体和二聚体的hla-g特异性抗体，从而完成了本发明。

3、因此，本发明的一个目的是提供一种hla-g特异性抗体或其抗原结合片段。

4、此外，本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其提供hla-g特异性抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

5、技术方案

6、为实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种抗hla-g抗体或其抗原结合片段，所述抗hla-g抗体或其抗原结合片段包含：

7、(a)包含seq id no:1的氨基酸序列的重链互补决定区1(cdr1)、包含seq id no:2的氨基酸序列的重链cdr2，以及包含seq id no:3的氨基酸序列的重链cdr3；和

8、包含seq id no:5的氨基酸序列的轻链cdr1、包含seq id no:6的氨基酸序列的轻链cdr2，以及包含seq id no:7的氨基酸序列的轻链cdr3；

9、(b)包含seq id no:9的氨基酸序列的重链cdr1、包含seq id no:10的氨基酸序列的重链cdr2，以及包含seq id no:11的氨基酸序列的重链cdr3；和

10、包含seq id no:13的氨基酸序列的轻链cdr1、包含seq id no:14的氨基酸序列的轻链cdr2，以及包含seq id no:15的氨基酸序列的轻链cdr3；

11、(c)包含seq id no:17的氨基酸序列的重链cdr1、包含seq id no:18的氨基酸序列的重链cdr2，以及包含seq id no:19的氨基酸序列的重链cdr3；和

12、包含seq id no:21的氨基酸序列的轻链cdr1、包含seq id no:22的氨基酸序列的轻链cdr2，以及包含seq id no:23的氨基酸序列的轻链cdr3；或

13、(d)包含seq id no:25的氨基酸序列的重链cdr1、包含seq id no:26的氨基酸序列的重链cdr2，以及包含seq id no:27的氨基酸序列的重链cdr3；和

14、包含seq id no:29的氨基酸序列的轻链cdr1、包含seq id no:30的氨基酸序列的轻链cdr2，以及包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链cdr3。

15、在本发明中，抗hla-g抗体或其抗原结合片段可包含以下序列：

16、(a)包含seq id no:4的氨基酸序列或与seq id no:4的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:8的氨基酸序列或与seq id no:8的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的轻链可变区；

17、(b)包含seq id no:12的氨基酸序列或与seq id no:12的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:16的氨基酸序列或与seq idno:16的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的轻链可变区；

18、(c)包含seq id no:20的氨基酸序列或与seq id no:20的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:24的氨基酸序列或与seq idno:24的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的轻链可变区；或

19、(d)包含seq id no:28的氨基酸序列或与seq id no:28的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:32的氨基酸序列或与seq idno:32的氨基酸序列具有80％或更大同源性的氨基酸序列的轻链可变区。

20、更具体地，在本发明的一个实施方式中，抗hla-g抗体或其抗原结合片段可包含以下序列：

21、(a)包含seq id no:4的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:8的氨基酸序列的轻链可变区；

22、(b)包含seq id no:12的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:16的氨基酸序列的轻链可变区；

23、(c)包含seq id no:20的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:24的氨基酸序列的轻链可变区；或

24、(d)包含seq id no:28的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:32的氨基酸序列的轻链可变区。

25、如本文所用，术语“抗体”是指用作特异性识别抗原的受体的蛋白质分子，包括在免疫学上对特定抗原具有反应性的免疫球蛋白分子。抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆和/或多克隆抗体的混合物、全长抗体和抗体片段。全长抗体或完整抗体可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构或具有含有如本文所定义的可结晶片段(fc)区域的重链的抗体。

26、此外，抗体可包括二价或双特异性分子(例如，双特异性抗体)。另外，根据序列的来源，抗体可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

27、如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上相同的抗体群体获得的单一分子组成的抗体分子，并且此类单克隆抗体表现出对特定表位的单一结合和亲和力，这与可结合多个表位的多克隆抗体不同。如本文所用，术语“全长抗体”具有包含两条全长轻链和两条全长重链的结构，每条轻链通过二硫键与重链连接。重链恒定区具有伽玛(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)和艾普西龙(ε)型，并且具有伽玛1(γ1)、伽玛2(γ2)、伽玛3(γ3)、伽玛4(γ4)、阿尔法1(α1)和阿尔法2(α2)作为亚类。轻链恒定区具有喀帕(κ)和拉姆达(λ)型。igg具有亚型，包括igg1、igg2、igg3和igg4。

28、如本文所用，术语“重链”可包括全长重链，所述全长重链包含可变区vh(其包含具有足够的可变区序列以赋予对抗原的特异性的氨基酸序列)和三个恒定区ch1、ch2和ch3及其片段。另外，如本文所用，术语“轻链”可包括全长轻链，所述全长轻链包含可变区vl(其包含具有足够的可变区序列以赋予对抗原的特异性的氨基酸序列)和恒定区cl及其片段。

29、如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。例如，存在通过将小鼠抗体的可变区与人抗体的恒定区重组而形成的嵌合抗体，并且它是与小鼠抗体相比免疫反应大大改善的抗体。

30、如本文所用，术语“人源化抗体”是指通过对源自非人物种的抗体的蛋白质序列进行修饰，以使其与在人体中天然产生的抗体相似而形成的抗体。例如，可通过将源自小鼠的cdr与源自人抗体的框架区(fr)重组以产生人源化可变区，并将其与优选的人抗体恒定区重组来产生人源化抗体。然而，当仅进行cdr移植时，人源化抗体的亲和力降低，因此，通过用小鼠抗体的fr氨基酸残基取代被认为影响cdr的三维结构的若干重要的fr氨基酸残基，可使亲和力升高至与原始小鼠抗体相同的水平。

31、此外，本发明提供了抗hla-g抗体的抗原结合片段。抗原结合片段可选自由以下组成的组：抗原结合片段(fab)、fab'、f(ab')2、可变片段(fv)、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、单链fv(scfv)、双抗体、三抗体和四抗体。

32、如本文所用，术语“片段”、“抗体片段”、“抗原结合片段”或“抗原结合结构域”可互换使用，是指本发明抗体的任何具有抗体的抗原结合功能的片段。示例性抗原结合片段包括fab、fab'、f(ab')2和fv，但不限于此。

33、fab具有一个抗原结合位点，其结构具有轻链和重链的可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定区(ch1结构域)。fab'与fab的不同之处在于它在重链ch1结构域的c末端具有包括一个或多个半胱氨酸残基的铰链区。当fab’的铰链区中的半胱氨酸残基形成二硫键时产生f(ab')2抗体。fv是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段，并且用于产生fv片段的重组技术公开于pct国际专利公布wo 88/10649、wo 88/106630、wo 88/07085、wo88/07086和wo 88/09344等中。双链fv具有通过非共价键连接的重链可变区和轻链可变区，并且单链fv通常具有经由肽接头通过共价键连接或直接连接在c末端的重链可变区和轻链可变区，使得可形成类似双链fv的二聚体结构。这些抗体片段可使用蛋白酶获得(例如，可通过用木瓜蛋白酶限制性消化整个抗体来获得fab，并且可通过用胃蛋白酶消化来获得f(ab')2片段)，并且可优选地通过基因重组技术产生。

34、双抗体是由两个重链可变结构域和两个轻链可变结构域组成的小的二价抗体，每个轻链可变结构域通过短接头与重链可变结构域连接。当轻链可变结构域通过短得多的接头与重链可变结构域连接时，可形成三抗体或四抗体。

35、此外，本发明的抗体或其抗原结合片段不仅可包括本文所述的抗hla-g抗体的序列，而且还可包括其生物学等同物(在能够表现出对hla-g的结合能力的范围内)。例如，可对抗体的氨基酸序列进行进一步改变以进一步改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或取代。此类氨基酸突变是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性进行的，诸如疏水性、亲水性、电荷、大小等。通过分析氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型，可以看出，精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似的大小；并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这一点，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可被视为生物功能等同物。

36、本发明的另一方面是一种编码抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。抗体及其抗原结合片段如上所述。

37、如本文所用，术语“核酸”具有综合含义，包括dna(基因组dna(gdna)和互补dna(cdna))和rna分子，以及作为核酸分子的基本单位的核苷酸，不仅包括天然核苷酸，而且还包括其中糖或碱基部分被修饰的类似物(scheit,nucleotide analogs,john wiley,newyork(1980)；uhlman和peyman,chemical reviews(1990)90:543-584)。本发明的编码重链和轻链可变区的核酸分子的序列可被修饰，并且修饰包括核苷酸的添加、缺失，或者非保守或保守取代。

38、在本发明中，分离的核酸可包含以下序列：

39、(a)seq id no:37的核苷酸序列或与seq id no:37的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列以及seq id no:38的核苷酸序列或与seq id no:38的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列；

40、(b)seq id no:39的核苷酸序列或与seq id no:39的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列以及seq id no:40的核苷酸序列或与seq id no:40的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列；

41、(c)seq id no:41的核苷酸序列或与seq id no:41的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列以及seq id no:42的核苷酸序列或与seq id no:42的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列；或

42、(d)seq id no:43的核苷酸序列或与seq id no:43的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列以及seq id no:44的核苷酸序列或与seq id no:44的核苷酸序列具有80％或更大同源性的核苷酸序列。

43、更具体地，在本发明的一个实施方式中，分离的核酸可包含以下序列：

44、(a)seq id no:37的核苷酸序列和seq id no:38的核苷酸序列；

45、(b)seq id no:39的核苷酸序列和seq id no:40的核苷酸序列；

46、(c)seq id no:41的核苷酸序列和seq id no:42的核苷酸序列；或

47、(d)seq id no:43的核苷酸序列和seq id no:44的核苷酸序列。

48、本发明的仍另一方面是一种包含核酸分子的重组载体。

49、如本文所用，术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的工具，包括质粒载体；粘粒载体；以及病毒载体，诸如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体，并且可优选为质粒载体，但不限于此。

50、根据本发明的一个实施方式，本发明的包含核酸分子的重组载体可包含编码包含以下cdr或包含包括以下cdr的重链和/或轻链可变区的序列的核酸分子：

51、(a)包含seq id no:1的氨基酸序列的重链cdr1、包含seq id no:2的氨基酸序列的重链cdr2，以及包含seq id no:3的氨基酸序列的重链cdr3；和

52、包含seq id no:5的氨基酸序列的轻链cdr1、包含seq id no:6的氨基酸序列的轻链cdr2，以及包含seq id no:7的氨基酸序列的轻链cdr3；

53、(b)包含seq id no:9的氨基酸序列的重链cdr1、包含seq id no:10的氨基酸序列的重链cdr2，以及包含seq id no:11的氨基酸序列的重链cdr3；和

54、包含seq id no:13的氨基酸序列的轻链cdr1、包含seq id no:14的氨基酸序列的轻链cdr2，以及包含seq id no:15的氨基酸序列的轻链cdr3；

55、(c)包含seq id no:17的氨基酸序列的重链cdr1、包含seq id no:18的氨基酸序列的重链cdr2，以及包含seq id no:19的氨基酸序列的重链cdr3；和

56、包含seq id no:21的氨基酸序列的轻链cdr1、包含seq id no:22的氨基酸序列的轻链cdr2，以及包含seq id no:23的氨基酸序列的轻链cdr3；或

57、(d)包含seq id no:25的氨基酸序列的重链cdr1、包含seq id no:26的氨基酸序列的重链cdr2，以及包含seq id no:27的氨基酸序列的重链cdr3；和

58、包含seq id no:29的氨基酸序列的轻链cdr1、包含seq id no:30的氨基酸序列的轻链cdr2，以及包含seq id no:31的氨基酸序列的轻链cdr3。

59、在本发明的载体中，编码轻链可变区的核酸分子和编码重链可变区的核酸分子可以可操作地连接至启动子。

60、如本文所用，术语“可操作地连接”是指核酸表达调控序列(例如，启动子、信号序列或转录因子结合位点阵列)与另一核酸序列之间的功能性连接，由此，调控序列调控其他核酸序列的转录和/或翻译。

61、本发明的重组载体系统可通过本领域已知的各种方法构建，其具体方法公开于sambrook等人,molecular cloning,a laboratory manual,cold spring harborlaboratory press(2001)，其通过引用并入本文。

62、本发明的载体通常可构建为用于克隆的载体或用于表达的载体。本发明的重组载体优选为表达载体。另外，本发明的载体可使用原核细胞或真核细胞作为宿主来构建。

63、例如，当本发明的载体为表达载体并且使用原核细胞作为宿主时，载体通常包含能够推进转录的强启动子(例如，tac启动子、lac启动子、lacuv5启动子、lpp启动子、plλ启动子、prλ启动子、rac5启动子、amp启动子、reca启动子、sp6启动子、trp启动子、t7启动子等)、用于起始翻译的核糖体结合位点，以及转录/翻译终止序列。当使用大肠杆菌(e.coli)(例如，hb101、bl21、dh5α等)作为宿主细胞时，大肠杆菌色氨酸生物合成途径的启动子和操纵子区域(yanofsky,c.,j.bacteriol.,(1984)158:1018-1024)和噬菌体λ的左侧启动子(leftward promoter)(plλ启动子，herskowitz,i.和hagen,d.,ann.rev.genet.,(1980)14:399-445)可用作调控区域。当使用芽孢杆菌属(bacillus)细菌作为宿主细胞时，苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)的毒素蛋白基因的启动子(appl.environ.microbiol.(1998)64:3932-3938；mol.gen.genet.(1996)250:734-741)或可在芽孢杆菌属细菌中表达的任何启动子可用作调控区域。

64、同时，本发明的重组载体可通过操纵本领域中常用的质粒(例如，pcl、psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex系列、pet系列和puc19等)、噬菌体(例如，λgt4·λb、λ-charon、λδz1和m13等)或病毒(例如，sv40等)来产生。

65、同时，当本发明的载体是表达载体并且使用真核细胞作为宿主时，可使用源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子和人肌肉肌酸启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、hsv tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、人免疫缺陷病毒长末端重复(hiv ltr)启动子、莫洛尼病毒启动子、eb病毒(ebv)启动子和劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子)，并且其通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。具体地，本发明的重组载体可包含cmv启动子。

66、本发明的重组载体可与另一序列融合以促进由其表达的抗体的纯化。融合序列包括例如谷胱甘肽s-转移酶(pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白(neb，美国)、flag(ibi，美国)和六聚组氨酸(6x his；quiagen，美国)。另外，由于通过本发明的载体表达的蛋白质是抗体，因此所表达的抗体可通过蛋白a柱等轻松纯化，而不需要附加序列用于纯化。

67、同时，本发明的重组载体可包含本领域常用的抗生素抗性基因作为选择标志物，并且可包含例如氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素的抗性基因。根据本发明的一个实施方式，抗hla-g表达载体可包含氨苄青霉素抗性基因。

68、本发明的表达抗体的载体可以是其中轻链和重链在单一载体中同时表达的载体系统，或者是其中轻链和重链各自在单独载体中表达的系统。在后一种情况下，通过共转化和靶向转化将两种载体引入宿主细胞中。共转化是将编码轻链和重链的相应载体dna同时引入宿主细胞中，然后选择表达轻链和重链两者的细胞的方法。靶向转化是选择用包含轻链(或重链)的载体转化的细胞，并且将所选择的表达轻链的细胞再次用包含重链(或轻链)的载体转化以最终选择表达轻链和重链两者的细胞的方法。

69、将本发明的编码抗体的重链和轻链的核酸插入编码人igg1、igg2、igg4的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中。轻链和重链可克隆在相同或不同的表达载体中。编码免疫球蛋白链的dna序列可操作地连接至表达载体中的控制序列，以确保免疫球蛋白多肽的表达。此类控制序列包括信号序列、启动子、增强子和转录终止序列。表达载体是宿主染色体dna或附加体的组成部分，并且可在宿主生物体中复制。

70、当抗体的重链和轻链分别克隆到单独载体中时，可将编码重链和轻链的表达载体共转染到单一宿主细胞中以表达两条链，并且链可在体内或体外组装形成完整抗体。

71、或者，可将编码重链的表达载体和编码轻链的表达载体引入不同的宿主细胞中，以分别表达重链和轻链，然后可在体外纯化和组装所述链以形成完整抗体。如本文所述的抗体或其片段可在原核或真核表达系统诸如细菌、酵母、丝状真菌、昆虫和哺乳动物细胞中产生。尽管本发明的重组抗体不一定需要糖基化或在真核细胞中表达，但通常优选在哺乳动物细胞中表达。可用的哺乳动物宿主细胞系的示例是人胚胎肾细胞系(hek 293细胞)、乳仓鼠肾细胞(bhk细胞)、中国仓鼠卵巢细胞/-或+二氢叶酸还原酶(dhfr)(cho、cho-s、cho-dg44、flp-in cho细胞)、非洲绿猴肾细胞(vero细胞)以及人肝细胞(hep g2细胞)。

72、用于这些细胞的表达载体可包含表达控制序列，诸如复制起点、启动子和增强子，以及必要的加工信息位点，诸如核糖体结合位点、rna剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是衍生自免疫球蛋白基因、猿猴病毒40(sv40)、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。含有用于产生抗体的质粒序列的载体可通过众所周知的方法转移到宿主细胞中，所述方法可根据宿主细胞的类型而变化。

73、本发明的又另一方面是一种包含重组载体的宿主细胞。优选地，本发明的宿主细胞是用重组载体转化的宿主细胞。

74、能够稳定且连续地克隆和表达本发明的载体的宿主细胞可以是本领域已知的任何宿主细胞并且可包括，例如，原核宿主细胞诸如大肠杆菌(escherichia coli)、芽孢杆菌属诸如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌、链霉菌属(streptomyces)、假单胞菌属(pseudomonas)(例如，恶臭假单胞菌(pseudomonas putida))、奇异变形杆菌(proteus mirabilis)或葡萄球菌属(staphylococcus)(例如，肉葡萄球菌(staphylococcus carnosus))的菌株，但不限于此。

75、用载体转化的合适的真核宿主细胞可以是真菌诸如曲霉属(aspergillus)物种、酵母诸如巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)和粗糙脉孢菌(neurospora crassa)、其他低等真核细胞、高等真核细胞诸如昆虫来源的细胞，以及源自植物或哺乳动物的细胞，但不限于此。

76、具体地，宿主细胞可以是猴肾细胞7(cos7)、ns0细胞、sp2/0、cho细胞、w138、bhk细胞、mardin darby狗肾(mdck)细胞、骨髓瘤细胞系、hut 78细胞或293细胞。

77、哺乳动物宿主细胞培养物优选用于表达和产生抗hla-g抗体或其抗原结合片段，因为本领域已经开发了多种能够分泌完整免疫球蛋白的合适的宿主细胞系。

78、在本发明中，“转化”和/或“转染”到宿主细胞中包括用于将核酸引入生物体、细胞、组织或器官中的任何方法，并且可通过选择适用于如本领域已知的宿主细胞的标准技术来进行。此类方法包括电穿孔、原生质体融合、磷酸钙(capo4)沉淀、氯化钙(cacl2)沉淀、使用碳化硅纤维搅拌、农杆菌(agrobacterium)介导的转化、聚乙二醇(peg)、硫酸葡聚糖、脂质体(lipofectamine)和干燥/抑制介导的转化方法，但不限于此。

79、本发明的又另一方面是一种用于产生抗hla-g抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养本发明的转化宿主细胞。优选地，本发明的用于产生抗hla-g抗体或其抗原结合片段的方法还可包括在培养的转化宿主细胞中表达抗hla-g抗体或其抗原结合片段。

80、在用于产生抗体或其抗原结合片段的方法中，转化宿主细胞的培养可根据本领域已知的适当的培养基和培养条件进行。本领域技术人员可根据所选菌株容易地调整和使用这样的培养过程。各种这些培养方法公开于各种文献中(例如，james m.lee,biochemicalengineering,prentice-hall international editions,138-176)。细胞培养根据细胞生长方法分为悬浮培养法和贴壁培养法，并且根据培养方法分为分批培养法、补料分批培养法和连续培养法。用于培养的培养基需要适当地满足特定菌株的需求。

81、在动物细胞培养中，培养基含有各种碳源、氮源和微量元素成分。可使用的碳源的示例包括碳水化合物诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素，脂肪诸如大豆油、葵花籽油、蓖麻油和椰子油，脂肪酸诸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇诸如甘油和乙醇，以及有机酸诸如乙酸，并且这些碳源可单独或组合使用。

82、可用于本发明的氮源包括有机氮源诸如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆(csl)和豆粕，以及无机氮源诸如脲、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，并且这些氮源可单独或组合使用。培养基可含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和对应的含钠盐作为磷源。另外，培养基可含有金属盐，诸如硫酸镁或硫酸铁。另外，还可含有氨基酸、维生素以及适当的前体。

83、在培养过程中，可以适当的方式将诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸等化合物添加到培养物中以调节培养物的ph。另外，在培养过程中，可使用消泡剂诸如脂肪酸聚二醇酯来抑制气泡形成。此外，为了维持培养物的需氧条件，将氧气或含氧气体(例如，空气)注入培养物中。培养物的温度通常可为20℃至45℃，优选25℃至40℃，但不限于此。

84、通过培养转化宿主细胞获得的抗体可以未纯化状态使用，并且可使用各种常规方法诸如渗析、盐沉淀和色谱将其进一步纯化至高纯度。其中，使用色谱的方法最常用，并且柱的类型和顺序可根据抗体的特征、培养方法等选自离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱。

85、根据本发明的抗hla-g抗体是使用hla-g的多聚体结构作为抗原产生的，并且其特征在于其能够结合hla-g单体和多聚体。由于已知hla-g抑制免疫细胞的激活并在癌细胞中过表达，本发明人确认了抗hla-g抗体的抗癌能力。

86、因此，确认了抗hla-g抗体抑制hla-g与cd8a的结合(表4)。此外，还确认，当将外周血单核细胞(pbmc，效应细胞)和用抗hla-g抗体处理的靶细胞与癌细胞混合并共培养时，癌细胞被杀死(图3)并且在肿瘤诱导的小鼠中肿瘤生长受到抑制(表6)。

87、因此，本发明的又另一方面提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

88、在本发明中，药物组合物可用于治疗过表达hla-g的癌症，但不限于此。癌症可选自由以下组成的组：胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌、结肠癌、鼻咽癌、口腔癌、甲状腺癌、前列腺癌、肾癌、胆囊癌、胆管癌、血癌、黑色素瘤等。

89、血癌可以是急性髓细胞性白血病(aml)、急性成淋巴细胞性白血病(all)、慢性髓性白血病(cml)、多发性骨髓瘤(mm)或淋巴瘤。

90、如本文所用，术语“预防”是指通过施用本发明的组合物来抑制或延迟疾病进展的任何行为，并且“治疗”是指抑制、减轻或消除疾病的发展。

91、本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的载剂，药学上可接受的载剂是制剂制备中常用的载剂并且包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。除了以上成分之外，本发明的用于预防或治疗癌症的组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。合适的药学上可接受的载剂和制剂详细描述于文献[remington'spharmaceutical sciences(第19版,1995)]中。

92、本发明的药物组合物可口服或肠胃外施用，并且在肠胃外施用的情况下，可通过静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、皮内施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用和直肠内施用等来施用。在口服施用的情况下，由于蛋白质或肽被消化，口服组合物可配制成包覆活性剂或保护其免于在胃中分解，并且本发明的组合物可通过允许活性物质移动至靶细胞的任何装置来施用。

93、本发明的药物组合物的合适剂量取决于诸如配制方法、施用方法、患者的年龄、体重、性别和病理状况、食物、施用时间、施用途径、排泄速率和反应敏感性等因素而变化，并且普通技术的医生可容易地确定对期望的治疗或预防有效的剂量并开出处方。根据本发明的一个实施方式，本发明的药物组合物的日剂量可为0.1mg/kg至100mg/kg，优选0.1mg/kg至10mg/kg，并且更优选0.1mg/kg至2mg/kg。如本文所用，术语“药学有效量”是指足以治疗、预防和诊断疾病的量。

94、本发明的药物组合物可以单位剂量形式制备，或者可通过将其放入多剂量容器中，通过使用药学上可接受的载剂和/或赋形剂根据本发明所属领域的技术人员可容易实施的方法配制来制备。此时，制剂可以是在油或含水介质中的溶液、悬浮液或乳液的形式，或者它可以是提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式，并且还可含有分散剂和/或稳定剂。

95、本发明的组合物可作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用，并且可与常规治疗剂顺序或同时施用。

96、本发明的抗体或其抗原结合片段可通过将其以抗体-治疗剂(功能性分子)和双特异性抗体-治疗剂(功能性分子)缀合物的形式施用于活体来用于治疗癌症。在例如文献[trouet等人,plenum press,new york and london,(1982)19-30]中已经报道了适合且优选用于将药物靶向特定靶位点的各种条件。

97、本发明的抗体或其抗原结合片段可进一步与功能性分子组合或共同施用，以用于预防、治疗和诊断与hla-g过表达相关的疾病。功能性分子可包括化学物质、放射性核素、免疫治疗剂、细胞因子、趋化因子、毒素、生物制剂和酶抑制剂。

98、本发明的又另一方面提供了一种诊断、预防或治疗与hla-g过表达相关的疾病(例如癌症)的方法，所述方法包括以药学有效量向受试者，例如人或非人哺乳动物施用本发明的抗体或其抗原结合片段、药物组合物。本发明还提供了一种诊断与hla-g过表达相关的疾病(例如癌症)的方法，所述方法包括向有需要的受试者，例如人或非人哺乳动物施用本发明的抗体或其抗原结合片段。

99、如本文所用，术语“受试者”是指已经发展或可能发展与hla-g过表达相关的疾病的任何动物，包括人、猴、牛、马、羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子或豚鼠。

100、同时，本发明人确认了抗体和hla-g的结合位点，并且因此，确认了在用于抗体筛选的抗原的氨基酸序列(seq id no:33)中，氨基酸339至344(dyeatl)、氨基酸390至402(vvvpsgeeqrytc)和氨基酸323至338(qradppkthvthhpvf)是表位。

101、因此，本发明的又另一方面提供了一种hla-g表位，其由选自由seq id no:34至36组成的组的序列组成。

102、如本文所用，术语“表位”是指抗体或其片段可特异性地结合的抗原局部位点。表位通常由分子的表面基团，诸如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征和特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下丧失与构象表位的结合，而不丧失与非构象表位的结合。表位可包括直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其他氨基酸残基，诸如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(即，氨基酸残基存在于特异性抗原结合肽的足迹内)。

103、本发明还提供了一种与hla-g表位特异性结合的抗体，并且抗体的具体示例与上述相同，但不限于此。

104、有益效果

105、根据本发明的抗hla-g抗体可以结合hla-g的单体和多聚体，并且因此可以有效阻断hla-g与其受体的结合。

技术特征：

1.一种抗人白细胞抗原-g(hla-g)抗体或其抗原结合片段，包含：

2.如权利要求1所述的抗hla-g抗体或其抗原结合片段，其中所述hla-g特异性抗体或其抗原结合片段包含：

3.如权利要求1所述的抗hla-g抗体或其抗原结合片段，其中所述抗hla-g抗体是重组抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆和/或多克隆抗体的混合物、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

4.如权利要求1所述的抗hla-g抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自由以下组成的组：抗原结合片段(fab)、fab'、f(ab')2、可变片段(fv)、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、单链fv(scfv)、双抗体、三抗体和四抗体。

5.一种分离的核酸，其包含编码如权利要求1所述的抗hla-g抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

6.一种载体，其包含如权利要求5所述的分离的核酸。

7.一种宿主细胞，其包含如权利要求6所述的载体。

8.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含一种或多种选自由以下组成的组的活性成分：

9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌、结肠癌、鼻咽癌、口腔癌、甲状腺癌、前列腺癌、肾癌、胆囊癌、胆管癌、血癌和黑色素瘤。

10.一种用于预防或治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用如权利要求1所述的抗hla-g结合抗体或其抗原结合片段或如权利要求8所述的药物组合物。

11.一种hla-g表位，其由选自由seq id no:34至36组成的组的序列组成。

12.一种抗体，其结合由选自由seq id no:34至36组成的组的序列组成的hla-g表位。

技术总结
本发明涉及一种特异性结合HLA‑G的抗体及其在癌症治疗中的用途，所述抗体结合HLA‑G单体和聚合物，从而阻止HLA‑G与其受体的结合，从而被有效地用于癌症治疗。

技术研发人员：卞盛铉,金着喜,尹大世,李种贤,郑升喜,姜炫朱,李庭旼,河敬植,尹善河,金秀盈,朴范灿
受保护的技术使用者：怡诺安有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5