一种微卫星DNA扩增引物对及二代测序方法

本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及一种微卫星dna扩增引物对及二代测序方法。

背景技术：

1、高通量测序技术快速发展使得测序通量显著增加和成本快速下降，研究人员能够通过测序的手段更加直接和全面地获得个体或群体的基因组序列信息。基因组测序理论上可以获得其基因组上几乎所有的变异，为遗传研究、动植物育种和疾病研究等提供最全面的材料。然而，在群体水平的研究中，对成百上千的样本进行全基因组深度测序需要极高的成本。

2、基因组测序是通过特定的技术手段来解析基因组中的脱氧核糖核酸（dna）碱基序列。随着技术的进步，基因组测序方法已从第一代测序（sanger测序）演进到第二代测序（包括454和illumina平台）和第三代测序（如pacbio和nanopore）。测序成本持续降低，使得测序通量增加和测序时间缩短，因此基因组测序技术广泛应用于更多的研究领域。基因组序列提供了研究基因功能、基因间的关联以及基因组各部分的协调等重要理论依据，例如在农业方面，高通量测序技术为种质资源鉴定、重要性状的定位和功能基因组挖掘提供了新的机遇，从而推动了动植物基因组选择育种，加速了育种进程，提高了分子育种效率。

3、二代测序（ngs）是一种高通量的dna测序技术，基于pcr和基因芯片的发展。其技术流程主要包括基因组dna提取、文库构建、上机测序、数据分析等步骤。文库构建是dna片段加接头的修饰过程，是整个二代测序过程中的关键环节，其质量直接影响后续的测序数据质量。所有二代测序平台都需要一个基因文库，包含通过特定引物或连接而形成的接头序列。通常，通过酶处理或超声处理随机裂解dna，并选择最佳的片段长度。最后，需要将dna片段两端加接头修饰后进行上机测序，并通过pcr实现文库的富集。二代测序技术在基因分型中有着广泛应用，包括snp分型、基因组重测序和rna测序等，这些技术的优势在于高通量、高准确性、高分辨率和低成本。单核苷酸多态性基因分型芯片（snp芯片）是一种基于微阵列技术的高通量基因分型工具，可以在一次实验中同时检测数十万到数百万个snps，为遗传多样性的分析提供了一种经济高效的方法，并广泛应用于遗传连锁图谱构建、进化关系研究、功能基因组学探索以及支持保护工作等方面。snp芯片的优点包括高通量和快速的数据处理速度，但它们的一个局限性是只能检测已知变异位点（通常人群频率超过1%），对于稀有变异的检测则需要更大的样本量。商业化snp芯片一般根据某些知名品种设计，与大多数研究的地方品种或闭锁群体的遗传距离较大，造成芯片的部分标记位点在特定群体中失效。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明创造的目的是提供一种用于建立测序文库的微卫星dna扩增引物对，所述引物对适用的物种数目多，检测结果准确可靠。

2、所述引物对包括左引物和右引物，所述引物包括ta[barcode]区域和保守序列结合区域，具体的：

3、所述左引物保守序列结合区域由5’至3’端为aaaagagagagagagt，对应的右引物保守序列结合区域由5’至3’端为tctctctctctctca；所述ta[barcode]区域连接于左引物或右引物5’端，所述barcode是遵循碱基平衡和/或激光平衡设计得到。

4、本发明还有一个目的是提供一种使用上述微卫星dna扩增引物对的基因组二代测序方法，包括如下步骤：

5、提取每个待测序样本的dna；

6、利用上述引物对将每个待测序样本的dna进行pcr扩增，得到测序文库；

7、对pcr扩增产物定量使其保持浓度一致再混合；

8、利用二代测序对所述测序文库进行测序得到测序数据，待测序样本通过不同的barcode区分，将测序数据映射到参考基因组或者单独组装，挖掘群体变异位点。

9、作为本发明更优的技术方案，所述待测序样本的dna提取方法为ctab法、sds法或磁珠法。

10、作为本发明更优的技术方案，所述待测序样本进行pcr扩增过程包括结合扩增和富集扩增；将上述引物结合到基因组上为结合扩增，其前五个循环分别在94℃、1分钟，35℃、1分钟和72℃、1分钟进行；富集扩增是将退火温度升至50℃进行35个循环。

11、作为本发明更优的技术方案，所述对pcr扩增产物定量的浓度为200ng/ul。

12、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

13、本发明提供的引物对适用的物种数目多，可以适用于常见的作物中，在本发明中验证了大豆和玉米，检测结果准确可靠。

14、本发明提供的测序方法中测序文库制备时间减少，利用多个barcode同时测序，减少成本以及增加速率，根据pcr扩增后的结果混样测序，能使测序产出的数据量较均一。

技术特征：

1.一种微卫星dna扩增引物对，其特征在于：

2.一种基因组二代测序方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述基因组二代测序方法，其特征在于：所述待测序样本的dna提取方法为ctab法、sds法或磁珠法。

4.根据权利要求2所述基因组二代测序方法，其特征在于：所述待测序样本进行pcr扩增过程包括结合扩增和富集扩增；将引物结合到基因组上为结合扩增，其前五个循环分别在94℃、1分钟，35℃、1分钟和72℃、1分钟进行；富集扩增是将退火温度升至50℃进行35个循环。

5.根据权利要求2所述基因组二代测序方法，其特征在于：所述对pcr扩增产物定量的浓度为200ng/ul。

技术总结
本发明涉及生物基因工程领域，尤其涉及一种微卫星DNA扩增引物对及二代测序方法；引物对包括左引物和右引物，引物包括TA[barcode]区域和保守序列结合区域，所述左引物保守序列结合区域为AAAAGAGAGAGAGAGT，对应的右引物保守序列结合区域为TCTCTCTCTCTCTCA，所述TA[barcode]区域连接于左引物或右引物5’端，所述测序方法成本低但速率增加，其是在PCR扩增后混样测序，能使测序产出的数据量较均一。

技术研发人员：夏志强,许睿,陈建元,罗璇
受保护的技术使用者：海南大学三亚南繁研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5