一种区分番木瓜炭疽病抗性品种的DNA探针、试剂盒及方法

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种区分番木瓜炭疽病抗性品种的dna探针、试剂盒及方法。

背景技术：

1、番木瓜（carica papaya l.）是番木瓜科番木瓜属植物，原产热带美洲，自明清时期传入中国，至今已在我国南方热带及亚热带地区多地种植，是一种用途广泛的热带草本果树，其果实营养价值高、富含蛋白酶，既可做水果鲜食，又可作工业提取与加工，被广泛应用与食品、药品等多个行业。

2、炭疽病是一种常见的植物病害，番木瓜炭疽病病原为炭疽菌（colletotrichumsp.），侵染植物后可使植物组织坏死，症状表现为深褐色凹陷病斑，茎叶与果实均可发病。番木瓜炭疽病是番木瓜重要采后病害，造成番木瓜产量下降、果实病变等问题，对番木瓜产业有极大危害，因而番木瓜品种的炭疽病抗性对番木瓜引种、生产和布局十分重要。番木瓜不同的品种具备不同的炭疽病抗性，在引种和作物布局工作上需要对此进行考虑，而依靠传统形态学特征对番木瓜种质进行区分较为困难，因而不同炭疽病抗性品种的分子生物学鉴别方法十分重要。

3、分子鉴定技术是一种基于生物基因组差异进行分子水平信息鉴定的技术，相比于传统形态学特征鉴定的主观性、复杂性，分子鉴定技术可以将物种间的区别以序列数据的形式可观化、简单化，以更为高效地获得更加可靠的鉴定结果。

4、叶绿体基因组（cpdna）分子标记在植物科学领域中具有重要意义，特别是在系统发育、进化生物学、物种鉴定、种群遗传学以及生态学和保护生物学等方面。叶绿体基因组通常是单一的环形分子，大小在120-160 kb范围内，包含一系列编码光合作用、电子传递和其他生物合成途径的基因，其具有高度的遗传稳定性、低重组率和母体遗传特性。这些特点使得叶绿体基因组成为高效和可靠的分子标记，能够提供高解析度的信息，特别适用于解析疏远亲缘关系的植物和评估种群结构、基因流以及历史动态。通过比较不同物种或种群的叶绿体基因组，研究人员可以更深入地了解植物如何适应各种生态环境以及背后的演化机制，从而为生物多样性保护和可持续利用提供科学依据。

5、本研究对番木瓜多个品种的叶绿体基因组测序、组装、分析，获取了在炭疽病抗性方面具有差异的多个番木瓜品种的叶绿体基因组差异位点，以此开发分子标记探针，区分番木瓜炭疽病不同抗性的品种。

技术实现思路

1、为解决上述技术中存在的问题，本发明提供一种区分番木瓜炭疽病抗性品种的dna探针，所述dna探针的核苷酸序列如seq.id.no.1所示。

2、其中，所述dna探针上标记有示踪标记。

3、其中，所述示踪标记为同位素标记或非同位素标记。

4、其中，所述非同位素标记为酶或有色基团。

5、其中，所述番木瓜炭疽病抗性品种为大青、红妃和台农，所述番木瓜炭疽病非抗性品种为广蜜、红铃、桂热和琼海黄。

6、一种区分番木瓜炭疽病抗性品种的方法，包括如下步骤：

7、s1提取待测植物的叶绿体基因组dna，所述待测植物为番木瓜，所述番木瓜品种选自大青、红妃、台农、广蜜、红铃、桂热和琼海黄；

8、s2以该植物的叶绿体基因组为模板进行pcr扩增，使用前述的dna探针检测叶绿体特异性基因是否存在；

9、s3若叶绿体特异性基因不存在，则判断该植物为番木瓜炭疽病抗性品种，所述番木瓜炭疽病抗性品种为大青、红妃和台农。

10、一种区分番木瓜炭疽病抗性品种的试剂盒，试剂盒包括前述的dna探针。

11、本发明根据番木瓜各品种的叶绿体基因组序列对齐结果，我们发现了多个差异位点，其中60 kb附近区域存在一段差异位点。通过这一个位点，我们可以区分不同炭疽病抗性的番木瓜品种，为分子标记的理想位点。我们截取了差异位点的上下游约250 bp的序列作为参考序列选取同源序列设计引物，番木瓜各品种样品的dna作为模板进行pcr扩增，在7个模板中均能扩增出单一明亮、与预期大小一致的条带，证明对叶绿体基因组序列分析得到的差异位点片段存在且可进行扩增和鉴定。

12、对pcr扩增产物进行sanger测序，并将测序结果进行比对，比对结果证实在此位点存在一个8 bp的差异位点能够将不同炭疽病抗性的番木瓜品种区分开，依据该位点设计了寡核苷酸荧光探针，可应用rpa（recombinase polymerase amplification）等分子生物学方法对番木瓜叶片组织进行检测，通过是否存在荧光信号即可实现其分子鉴定，以此能够高效区分番木瓜不同炭疽病抗性的品种。

技术特征：

1.一种区分番木瓜炭疽病抗性品种的dna探针，其特征在于，所述dna探针的核苷酸序列如seq.id.no.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种区分番木瓜炭疽病抗性品种的dna探针，其特征在于，所述dna探针上标记有示踪标记。

3.根据权利要求2所述的一种区分番木瓜炭疽病抗性品种的dna探针，其特征在于，所述示踪标记为同位素标记或非同位素标记。

4.根据权利要求3所述的一种区分番木瓜炭疽病抗性品种的dna探针，其特征在于，所述非同位素标记为酶或有色基团。

5.根据权利要求1-4任一所述的一种区分番木瓜炭疽病抗性品种的dna探针，其特征在于，所述番木瓜炭疽病抗性品种为大青、红妃和台农，所述番木瓜炭疽病非抗性品种为广蜜、红铃、桂热和琼海黄。

6.一种区分番木瓜炭疽病抗性品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.一种区分番木瓜炭疽病抗性品种的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括如权利要求1-5任一所述的dna探针。

技术总结
本发明涉及一种区分番木瓜炭疽病抗性品种的DNA探针、试剂盒及方法，DNA探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。根据番木瓜各品种的叶绿体基因组序列对齐结果，我们发现了多个差异位点，其中60 kb附近区域存在一段差异位点。通过这一个位点，我们可以区分不同炭疽病抗性的番木瓜品种，为分子标记的理想位点。我们截取了差异位点的上下游约250 bp的序列作为参考序列选取同源序列设计引物，番木瓜各品种样品的DNA作为模板进行PCR扩增，在7个模板中均能扩增出单一明亮、与预期大小一致的条带，证明对叶绿体基因组序列分析得到的差异位点片段存在且可进行扩增和鉴定，依据该位点设计了寡核苷酸荧光探针。

技术研发人员：孔华,郭静远,郝志刚,郭安平,贾瑞宗,郭运玲,徐嘉擎,于铖儇
受保护的技术使用者：中国热带农业科学院三亚研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5