用于增加体外胚胎内细胞团细胞数的组合物及方法和应用
本发明属于体外受精，特别是涉及用于增加体外胚胎内细胞团细胞数和细胞占比的组合物及方法和应用。
背景技术：
1、体外受精已经广泛应用于提高优质种畜快速扩繁和人类辅助生殖领域。然而，体外受精获得的胚胎移植后妊娠率远低于体内受精胚胎的妊娠率，说明体外胚胎发育潜能低于体内胚胎。体外胚胎的发育潜能是决定体外胚胎移植成功的关键，也是一直以来体外胚胎技术的难点。胚胎发育潜能与第一次细胞分化（即分化为内细胞团(icm)和滋养层(te)）密切相关。由于内细胞团和滋养层细胞将分别发育为胎儿和胎盘，内细胞团细胞数目及占比是评估囊胚发育潜能的重要指标。已有报道指出体外的培养环境影响内细胞团细胞数目及占比，小鼠和牛体外受精后的囊胚icm/te比例比体内囊胚低14%-23%，也是决定体外胚胎发育潜能低的重要因素。
2、近年来，研究人员建立了家畜囊胚体外延时培养体系，用来评估体外受精胚胎的后续发育潜能。囊胚体外延时培养体系相较于用胚胎移植来判定胚胎发育潜能的方法，大幅节约时间和资金成本；此外，囊胚体外延时培养体系也可作为研究胚胎附植前后发育机制的模型，该体系可快速、高通量评估体外受精胚胎发育潜能的高低。有研究显示，囊胚内细胞团细胞数目及占比，与囊胚体外延时培养存活率、囊胚直径密切相关。
3、为提高体外胚胎内细胞团数目及占比，现有技术主要利用附植前的胚胎或者输卵管分泌因子的添加来调节体外胚胎的发育。例如，bmp，属于tgf-β超家族，可促进囊胚形成，bmp信号通过调控多能性和谱系特异性基因的表达，促进icm增殖并抑制te分化；egf是一种生长因子，可促进细胞增殖和分化，体外胚胎培养时添加egf可提高囊胚率。尽管近年来，人们在添加分泌因子改善体外胚胎发育方面取得了一定的进展，但是增加体外胚胎内细胞团细胞数目及占比的效果有限。因此，亟待建立更加有效的方法以提高体外胚胎内细胞团细胞数目及占比，以进一步提升体外胚胎技术水平。
技术实现思路
1、为解决上述现有技术中的至少部分技术问题，本发明通过在早期胚胎体外培养的培养液中添加叶酸和疏花丁素b中一种或两种调节剂，显著提高囊胚率、提高囊胚内细胞团细胞数和内细胞团细胞数的占比、提高囊胚延时培养的存活率和囊胚直径并有效提高体外胚胎发育潜能。具体地，本发明包括以下内容。
2、本发明的第一方面，提供一种增加体外胚胎内细胞团细胞数和细胞占比的组合物，其包括选自叶酸和疏花丁素b中的一种或者两种的调节剂。
3、在某些实施方案中，根据本发明所述的增加体外胚胎内细胞团细胞数和细胞占比的组合物，其中，所述组合物包含(a)-(c)中的任意一种：
4、(a) 叶酸；
5、(b) 疏花丁素b；
6、(c) 叶酸和疏花丁素b，且所述叶酸与疏花丁素b的浓度比为(0.001-100)：1。
7、在某些实施方案中，根据本发明所述的增加体外胚胎内细胞团细胞数和细胞占比的组合物，其中，所述叶酸的量能够使叶酸在体外培养时的工作浓度达到0.01-10 μm；所述疏花丁素b的量能够使疏花丁素b在体外培养时的工作浓度达到0.1-10 μm。
8、在某些实施方案中，根据本发明所述的增加体外胚胎内细胞团细胞数和细胞占比的组合物，其中，所述体外胚胎来源为哺乳动物体外受精胚胎。
9、在某些实施方案中，根据本发明所述的增加体外胚胎内细胞团细胞数及细胞占比的组合物，其中，进一步包括基础培养液。
10、本发明的第二方面，提供一种增加体外胚胎内细胞团细胞数及细胞占比的方法，其包括在体外使胚胎与根据本发明所述的组合物接触的步骤。
11、在某些实施方案中，根据本发明所述的增加体外胚胎内细胞团细胞数及占比的方法，其中，所述增加包括提高囊胚内细胞团细胞数和内细胞团细胞数占比。
12、本发明的第三方面，提供一种改善体外受精胚胎发育的方法，其包括在体外使胚胎与根据本发明所述的组合物接触的步骤。
13、在某些实施方案中，根据本发明所述的改善体外受精胚胎发育的方法，其中，所述改善包括提高卵裂率、提高囊胚发育率。
14、在某些实施方案中，根据本发明所述的改善体外受精胚胎发育的方法，其中，所述改善进一步包括提高囊胚体外延时培养的存活率和囊胚直径。
15、本发明的第四方面，提供根据本发明所述的组合物，或本发明所述的增加体外胚胎内细胞团细胞数及细胞占比的方法，或本发明所述的改善体外受精胚胎发育的方法在动物遗传改良、良种扩繁、体外胚胎生产或辅助生殖中的应用。
16、本发明针对体外受精胚胎在早期发育过程中囊胚阶段内细胞团细胞数少、囊胚率低、后续胚胎发育潜能低等问题，通过在早期胚胎体外培养的培养液中添加叶酸和疏花丁素b中的一种或两种调节剂，显著提高了囊胚率、提高了囊胚内细胞团细胞数和内细胞团细胞数占比、提高了囊胚延时培养的存活率和囊胚直径并有效提高了体外胚胎发育潜能。此外，本发明有效地提高体外受精胚胎可用于后续胚胎移植的比率，且成本低、安全、高效，为家畜体外胚胎生产和辅助生殖技术的发展提供了新的策略，具有广阔的应用前景。
技术特征：
1.一种增加体外胚胎内细胞团细胞数和细胞占比的组合物，其特征在于，包括选自叶酸和疏花丁素b中的一种或者两种的调节剂。
2.根据权利要求1所述的增加体外胚胎内细胞团细胞数和细胞占比的组合物，其特征在于，所述组合物包含(a)-(c)中的任意一种：
3. 根据权利要求1所述的增加体外胚胎内细胞团细胞数和细胞占比的组合物，其特征在于，所述叶酸的量能够使叶酸在体外培养时的工作浓度达到0.01-10 μm；所述疏花丁素b的量能够使疏花丁素b在体外培养时的工作浓度达到0.1-10 μm。
4.根据权利要求1所述的增加体外胚胎内细胞团细胞数和细胞占比的组合物，其特征在于，所述体外胚胎来源为哺乳动物体外受精胚胎。
5.根据权利要求1所述的增加体外胚胎内细胞团细胞数和细胞占比的组合物，其特征在于，进一步包括基础培养液。
6.一种增加体外胚胎内细胞团细胞数和细胞占比的方法，其特征在于，包括在体外使胚胎与根据权利要求1-5任一项所述的组合物接触的步骤。
7.根据权利要求6所述的增加体外胚胎内细胞团细胞数和细胞占比的方法，其特征在于，所述增加包括提高囊胚内细胞团细胞数和内细胞团细胞数占比。
8.一种改善体外受精胚胎发育的方法，其特征在于，包括在体外使胚胎与根据权利要求1-5任一项所述的组合物接触的步骤。
9.根据权利要求8所述的改善体外受精胚胎发育的方法，其特征在于，所述改善包括提高卵裂率、提高囊胚发育率。
10.根据权利要求8所述的改善体外受精胚胎发育的方法，其特征在于，所述改善包括提高囊胚体外延时培养的存活率和/或囊胚直径。
11.根据权利要求1-5任一项所述的组合物，或权利要求6或7所述的增加体外胚胎内细胞团细胞数和细胞占比的方法，或权利要求8或9或10所述的改善体外受精胚胎发育的方法在动物遗传改良、良种扩繁、体外胚胎生产或辅助生殖领域的应用。
技术总结
本发明公开用于增加体外胚胎内细胞团细胞数和细胞占比的组合物及方法和应用。本发明针对体外受精胚胎在早期发育过程中囊胚率低、囊胚阶段内细胞团细胞数少、内细胞团细胞占比低、后续胚胎发育潜能低等问题，通过在早期胚胎体外培养的培养液中添加叶酸和疏花丁素B中的一种或两种调节剂，显著提高囊胚率、囊胚内细胞团细胞数和内细胞团细胞数占比以及囊胚延时培养的存活率和囊胚直径，并有效提高体外胚胎发育潜能。此外，本发明还有效提高体外受精胚胎可后续进行胚胎移植的胚胎比率，成本低、安全、高效，为家畜体外胚胎生产和辅助生殖技术的发展提供新的策略，具有广阔的应用前景。
技术研发人员：田见晖,王银娟,魏翊,安磊,王书敏,初美强
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5