DaD27基因在调控参薯抗炭疽病中的应用

本发明属于基因工程，具体涉及 dad27基因在调控参薯抗炭疽病中的应用。

背景技术：

1、参薯为薯蓣科、薯蓣属的缠绕草质藤本。炭疽病是参薯生产中的主要病害，易侵染参薯叶片，严重时造成全株死亡，常造成参薯产量的大面积减产甚至绝收、经济损失严重。其中，参薯的拉丁名为 dioscorea alata。

2、目前，炭疽病的防治措施主要以化学防治为主，易造成环境污染，长期使用导致病原菌具有抗药性，化学试剂的残留严重时会引起人、畜中毒。因此，炭疽病防治应加快优质抗炭疽病新种质的培育，选育抗病品种是防止山药炭疽病大规模发生最根本的途径。但参薯炭疽病抗病机理不明，探明参薯抗炭疽病的分子机制对提高参薯炭疽病抗性和培育抗病新品种具有重要意义。

3、据报道，拟南芥中编码独脚金内酯合成关键酶dwarf27会负调控脱落酸合成前体9-顺式紫黄质，从而负调控脱落酸合成。近年研究表明，脱落酸能调控气孔的关闭，从而提高植物的抗旱能力。目前，需要开发负调控脱落酸的独脚金内酯合成关键酶基因参与其他方面的新应用。

技术实现思路

1、为开发一种负调控脱落酸的独脚金内酯合成关键酶基因参与其他方面的新应用，本发明发现了一种调控参薯炭疽病抗性的参薯 dad27基因，提供了参薯 dad27基因在提高植物抗逆性中的应用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

2、本发明提供了 dad27基因在调控参薯抗炭疽病中的应用，所述 dad27基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。所述 dad27基因为一种负调控脱落酸的独脚金内酯合成关键酶基因，且该基因可以用于调控参薯炭疽病抗性。本发明提供了该基因在调控参薯抗炭疽病中的应用，开发了一种负调控脱落酸的独脚金内酯合成关键酶基因参与其他方面的新应用。

3、优选地，所述 dad27基因表达的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、其中，所述参薯 dad27基因的获得方法如下：利用参薯转录组测序序列，在参薯全基因组和转录组数据库中进行核苷酸序列比对检索，获得的参薯 dad27基因的cdna序列。通过软件primer premire 5.0设计特异性引物d27_f和d27_r，以参薯cdna为模板扩增获得 dad27基因的核苷酸序列。

5、其中，全基因组和转录组数据库的网址为：https://yambase.org/。

6、参薯 dad27基因的cdna序列：dioal.11g002500.1。

7、d27_f的核苷酸序列如seq id no.3所示：

8、5’-atggagctcatctccttccc-3’。

9、d27_r的核苷酸序列如seq id no.4所示：

10、5’-tcatgcttgtaatttaggacaaattgg-3’。

11、本发明利用病毒诱导的基因沉默技术构建 dad27基因沉默参薯植株，并测定沉默参薯中脱落酸的含量及炭疽病抗性指标，证明 dad27基因在参薯抗炭疽病中的功能。其中，病毒诱导的基因沉默的英文名称为virus-induced gene silencing，vigs。脱落酸的英文名称为abscisic acid，aba。进一步的方案如下：

12、本发明通过病毒诱导的基因沉默技术使植物中的所述 dad27基因沉默，以获得炭疽病抗性增强的沉默植株。其中，所述植物为参薯。

13、优选地，所述病毒诱导的基因沉默技术是将沉默 dad27基因的重组载体转入参薯中，使参薯中的所述 dad27基因沉默，进而提高参薯的炭疽病抗性。

14、优选地，所述沉默 dad27基因的重组载体是利用vigs病毒载体构建得到的 dad27基因的沉默载体。

15、优选地，所述沉默 dad27基因的重组载体包括vigs病毒载体和插入所述vigs病毒载体的所述 dad27基因。

16、优选地，所述vigs病毒载体包括烟草脆裂病毒ptrv1载体或烟草脆裂病毒ptrv2载体。

17、优选地，所述沉默 dad27基因的重组载体用于构建参薯 dad27基因vigs沉默体系。其中，参薯 dad27基因vigs沉默体系又称为基于 dad27基因的参薯叶片vigs体系。

18、优选地，所述参薯 dad27基因vigs沉默体系包括含有辅助载体的农杆菌菌液和含有所述沉默 dad27基因的重组载体的农杆菌菌液。

19、所述辅助载体为烟草脆裂病毒ptrv1载体。

20、优选地，所述沉默 dad27基因的重组载体为含目的基因片段的烟草脆裂病毒ptrv2载体，所述目的基因片段来源于参薯叶片，所述目的基因片段为dad27基因特异性片段，其核苷酸序列如seq id no.7所示。其中，所述沉默 dad27基因的重组载体简称为重组载体。

21、本发明基于上述辅助载体构建一种基于 dad27基因的参薯叶片vigs体系，具体的步骤如下：

22、（1）重组载体的构建

23、本发明所述表达 dad27基因的重组载体通过引物trv_d27_f和trv_d27_r扩增获得如seq id no.7所示的核苷酸序列后插入烟草脆裂病毒ptrv2载体的 xba i和 bamh i酶切位点间得到的载体；即seq id no.7的第1位5’端紧邻 xba i酶切位点，seq id no.7的最后1位3’端紧邻 bamh i酶切位点，得到重组载体ptrv2-dad27。重组载体ptrv2-dad27又简称为重组载体。

24、其中，trv_d27_f的核苷酸序列如seq id no.5所示：

25、5’-aaggttaccgaattctctagaggattgggactatgagagctttgt-3’。

26、trv_d27_r的核苷酸序列如seq id no.6所示：

27、5’-cgtgagctcggtaccggatccccactgttctccaaatacctgca-3’。

28、seq id no.7的核苷酸序列中5’端含有xbai酶切位点，3’端含有bamhi酶切位点，其核苷酸序列如下所示：

29、tctagaggattgggactatgagagctttgttgatgtctcaaagagagttatgatgggtaggaacaggacccagcaacaggttgttgttagggaggtccttctttctatgcttccccctggtgctcctgctcagtttaggaaattgtttccaccaacaaaatgggcagctgaattcaatgctgcattgacagtgcctttcttccattggcttgttggtccctctgaggttgtggaagttgaggtgaatggtgtaaagcaaaagagtggagtgcatataaaaaaatgcaggtatttggagaacagtggggatcc。

30、（2） dad27基因vigs沉默植株的构建

31、将步骤（1）中的重组载体ptrv2-dad27、烟草脆裂病毒ptrv2载体以及烟草脆裂病毒ptrv1载体分别转化到农杆菌gv3101感受态细胞，pcr鉴定阳性，分别获得含重组载体、烟草脆裂病毒ptrv2载体、烟草脆裂病毒ptrv1载体的菌液。

32、（3）将步骤（2）中的含重组载体、烟草脆裂病毒ptrv2载体、烟草脆裂病毒ptrv1载体的菌液在含kan 50mg/l，dif 25mg/l的lb液体培养基中，28℃摇床200rpm，振荡培养od600至1.0，室温离心后弃上清，收集菌体，用等体积ms侵染液重悬菌体，吸打混匀后分别将重组载体ptrv2-dad27和烟草脆裂病毒ptrv2载体与烟草脆裂病毒ptrv1载体等体积混合，黑暗静置4h；将所述ms侵染液分别注射到参薯叶片背面，实现对目标基因 dad27基因的沉默及对照植株的构建，其中重组载体ptrv2-dad27与烟草脆裂病毒ptrv1载体混合ms侵染液注射植株为目标基因 dad27沉默植株，烟草脆裂病毒ptrv2载体与烟草脆裂病毒ptrv1载体混合侵染液注射植株为对照植株。通过实时定量pcr方法，采用引物trv_d27_f和trv_d27_r检测各vigs植株中 dad27基因的表达量。

33、其中，ms侵染液的配方组成为：ms培养基＋10mm/l mes+200μm/l as+10mm/lmgcl2，ph=5.6。其中，mes的中文名称为2-吗啉乙磺酸；as的中文名称为乙酰丁香酮。

34、优选地，所述植物为参薯。

35、本发明提供了 dad27基因沉默参薯材料在调控参薯抗炭疽病中的应用。在正常生长条件下，降低目的植物中 dad27基因的表达量，能够增加参薯叶片中的脱落酸含量，使叶片气孔关闭，明显增强参薯植物的炭疽病抗性。本发明对于探讨脱落酸负调控基因 dad27基因与炭疽病抗性的分子机理的研究具有指导意义。

36、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

37、本发明提供了 dad27基因在调控参薯抗炭疽病中的应用。本发明提供了一种负调控aba合成基因 dad27基因的获得，以及其相关材料在炭疽病抗性中的功能验证，本发明在提高植物抗炭疽病方面具有潜在的应用前景。本发明提供了该基因在调控参薯抗炭疽病中的应用，开发了一种负调控脱落酸的独脚金内酯合成关键酶基因参与其他方面的新应用。

技术特征：

1.dad27基因在调控参薯抗炭疽病中的应用，其特征在于，所述dad27基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的dad27基因在调控参薯抗炭疽病中的应用，其特征在于，所述dad27基因表达的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3.根据权利要求1所述的dad27基因在调控参薯抗炭疽病中的应用，其特征在于，通过病毒诱导的基因沉默技术使参薯中的所述dad27基因沉默，以获得炭疽病抗性增强的沉默参薯。

4.根据权利要求3所述的dad27基因在调控参薯抗炭疽病中的应用，其特征在于，所述病毒诱导的基因沉默技术是将沉默dad27基因的重组载体转入参薯中，使参薯中的所述dad27基因沉默，进而提高参薯的炭疽病抗性。

5.根据权利要求4所述的dad27基因在调控参薯抗炭疽病中的应用，其特征在于，所述沉默dad27基因的重组载体是利用vigs病毒载体构建得到的dad27基因的沉默载体。

6.根据权利要求5所述的dad27基因在调控参薯抗炭疽病中的应用，其特征在于，所述沉默dad27基因的重组载体包括vigs病毒载体和插入所述vigs病毒载体的所述dad27基因。

7.根据权利要求6所述的dad27基因在调控参薯抗炭疽病中的应用，其特征在于，所述vigs病毒载体包括烟草脆裂病毒ptrv1载体或烟草脆裂病毒ptrv2载体。

8.根据权利要求4所述的dad27基因在调控参薯抗炭疽病中的应用，其特征在于，所述沉默dad27基因的重组载体用于构建参薯dad27基因vigs沉默体系。

9.根据权利要求8所述的dad27基因在调控参薯抗炭疽病中的应用，其特征在于，所述参薯dad27基因vigs沉默体系包括含有辅助载体的农杆菌菌液和含有所述沉默dad27基因的重组载体的农杆菌菌液；

技术总结
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及DaD27基因在调控参薯抗炭疽病中的应用。本发明提供的所述DaD27基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用病毒诱导的基因沉默技术构建DaD27基因沉默参薯植株，并测定沉默参薯中ABA含量及炭疽病抗性指标，证明DaD27基因在参薯抗炭疽病中的功能。

技术研发人员：罗莎,周庆红,黄英金,蒲俊宏,单楠,孙静宇,汪生林,朱强龙,范邓妹
受保护的技术使用者：江西农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5