一种利用LAMP技术快速检测帝王鲑成分的引物组、试剂盒、方法及其应用与流程

本发明属于分子生物，具体涉及一种利用lamp技术快速检测帝王鲑成分的方法，用于所述方法的特异性核苷酸引物组、以及包含所述引物组的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、三文鱼是世界著名的高值经济鱼类，而且是世界范围内广泛食用的一种油性鱼类，其肉质鲜嫩，口感绵柔，味道鲜美。鱼肉中富含ω-3不饱和脂肪酸、蛋白质和氨基酸，营养丰富，深受消费者喜爱。帝王鲑学名大鳞大马哈鱼（oncorhynchus tshawytscha），号称“三文鱼中的劳斯莱斯”，作为最高价值的三文鱼，其刺身肉质丰腴，口感绵密，口感好于其他三文鱼和虹鳟鱼。帝王鲑价格昂贵，明显高于其他三文鱼和虹鳟鱼，由于这几种鱼的纹理和外观极为相似，消费者无法通过外观进行区别，不法商贩便有了可乘之机，将价格较低的其他三文鱼或虹鳟鱼冒充帝王鲑，极大地损害了消费者的身体健康和合法权益。

2、目前利用实时荧光pcr技术检测鱼类源性成分已经成为鱼肉鉴别最常见的方法。此方法在实验过程中需要升温和降温，对于温度的控制要求非常高，因此使用的仪器非常复杂和精密，仪器价格较为昂贵，实验中使用的探针价格昂贵，成本很高。

3、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)作为近几年来的新型核酸扩增技术，克服了传统pcr和实时荧光pcr检测方法反复升降温、仪器精密、成本较高以及检测周期相对较长的缺点，可实现恒温条件下的连续快速扩增。本发明基于lamp等温扩增技术快速检测帝王鲑成分的方法，具有恒温、特异性强、灵敏度高、性价比高、操作简易和成本低等特点，在鉴定高价值三文鱼真伪和鱼肉制品的快速检测方面具有良好的应用前景。

技术实现思路

1、为解决上述实际问题，本发明的目的在于，使用lamp技术，简单、快速、低成本、特异且灵敏的检测帝王鲑成分。

2、本发明从帝王鲑的遗传背景分析，根据帝王鲑线粒体d-loop基因序列设计特异性核苷酸引物组，采用lamp技术对帝王鲑进行成分检测，从而达到鉴别帝王鲑真伪的目的。

3、本发明是通过以下技术方案实现的：

4、本发明用于lamp法快速检测帝王鲑成分的引物组包括：

5、外引物f3：5’-agggtcgaactagatcttga-3’

6、外引物b3：5’-aggggtttaacaggaacat-3’

7、内引物fip：5’-atgcacttgatatccaagtatgtgattccagggaactatgtattcatg-3’

8、内引物bip：5’-tcacagatatctaagatttccccggaaggatctttcagcgtagg-3’；扩增序列长度：199 bp。

9、本发明还提供用于lamp法检测帝王鲑成分的试剂盒，所述试剂盒包括上述特异性引物组。

10、进一步，所述试剂盒还包括lamp扩增反应液23 μl，包括以下组分：外引物f3(10 μmol/l)和外引物b3(10 μmol/l)各1 μl，内引物fip(10 μmol/l)和内引物bip(10 μmol/l)各4 μl，10×thermo pol buffer 2.5 μl，mgso4(100 mmol/l)1 μl，dntps(10 mmol/l)3 μl，甜菜碱(5 mol/l)5 μl，bst酶(8u/μl)1 μl，染料(250×)0.5 μl。

11、所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和空白对照，阴性对照为同体积不含阳性dna成分的其他物种基因组提取物，空白对照为同体积的ddh2o替代模板dna。

12、帝王鲑成分检测的lamp检测方法包括以下步骤：

13、（1）样品dna的提取：

14、取105 ℃烘干并用搅拌机打磨成干粉的样品约20 mg（19.90~20.10 mg），按照商业化dna提取试剂盒的步骤进行操作，用50 μl tae buffer或ddh2o溶解；

15、（2）lamp体系：

16、将提取的样品dna 2 μl加入到试剂盒lamp扩增反应液中；

17、（3）lamp反应程序：

18、恒温扩增仪：61 ℃，45 min；

19、qpcr仪：61 ℃ 60 s， 45个循环，每次循环时收集荧光。

20、其扩增结果的判断质量控制标准为：以下条件有一条不满足时，实验视为无效：

21、(a)空白对照：无荧光对数增长，相应的ct值＞43或无数值。

22、(b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的ct值＞43或无数值。

23、(c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的ct值＜40。

24、结果判定：当ct值＜43，则判定为被检样品阳性。当ct值≥43或无数值，则判定为被检样品阴性。

25、在上文所述的lamp检测方法中，所述的样品dna的制备方法不仅可以选用商业途径获得的dna提取试剂盒，还可以使用ctab法、碱裂解法等。

26、本发明具有以下有益效果：

27、（1）操作简单高效；整个反应过程仅需45 min便可完成，无需对核酸扩增产物进行电泳、纯化、测序、比对，具有防止污染、耗时短的优点。

28、（2）性价比高，成本较低；不需要精密复杂且价格昂贵的反复升降温仪器，仅需简单的恒温扩增仪便可完成，适用于广大基层及现场保障的快速检测，引物组不需要连接价格昂贵的探针和荧光基团。

29、（3）特异性强；本发明的特异性引物组包含四个引物，模板中任何区域与上述四个引物无法匹配均无法进行扩增，与帝王鲑同属大马哈鱼属且亲缘较近的虹鳟鱼和其他三文鱼（银鲑、红鲑、粉鲑、狗鲑、大西洋鲑）均无法检出。

30、（4）灵敏度较高，帝王鲑的基因组dna灵敏度可达到1 ng，质量分数灵敏度达到5%。

31、（5）本发明为加强高值三文鱼制品的监管力度，鉴定帝王鲑真伪，打击造假行为，保护消费者的合法权益提供了有效的技术手段，并且在鱼肉制品的快速检测方面具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种用于快速检测帝王鲑成分的引物组，其特征在于：包括一对外引物和一对内引物。

2.一种快速检测帝王鲑成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的用于检测帝王鲑成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括lamp扩增反应液。

4.帝王鲑成分的检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的引物组以及权利要求2和3所述的试剂盒。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括对样品dna的提取以及进行lamp扩增的体系和条件。

技术总结
本发明公开了一种利用LAMP等温扩增技术快速检测帝王鲑的引物组、试剂盒、方法及其应用。本发明还涉及用于所述方法的特异性核苷酸引物组、包含所述引物组的试剂盒，以及利用其检测食品中帝王鲑成分的方法。本发明具有特异性强、灵敏度高、操作简单、不需要复杂仪器、耗时短的优点。本发明为鉴定高价值三文鱼真伪，保护消费者的合法权益提供了有效的技术手段。

技术研发人员：李杰,张华
受保护的技术使用者：临沂市食品药品检验检测中心
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5