一种用于双通道检测Hg2+和Ag+的近红外荧光探针及其制备方法和应用
本发明涉及近红外荧光探针，尤其是涉及一种用于双通道检测hg2+和ag+的近红外荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术：
1、重金属污染中，汞是最常见的一种污染物，也是危害性最大的污染物，微量汞就能够对环境甚至人们的生命健康造成危害。汞及其化合物在工业生产、电器仪表、医药制造、金属提炼和军工等领域都得到了广泛的应用。随着汞及其化合物的大量使用及含汞废弃物的不合理处理，严重危害了水体、空气和土壤等环境，同时也对人类的安全造成了极大的威胁。同时，对长期暴露于高浓度汞环境下的工作人员的身体健康进行监测发现，长期接触高浓度汞的从业人员，其神经行为功能明显下降，主要表现为视觉感知、心理稳定度、手部反应能力及注意力等方面。
2、作为金属污染物之一的银，不仅具有生物学毒性，还能对土壤和水体造成污染。ag+能够通过皮肤负载、进食等方式进入水螅体内使其出现急性中毒，产生强烈应激反应。此外，ag+还会影响微生物世界中真菌、细菌、藻类、病毒和一些小型原生生物的活动。当人体摄入过量的ag+时，能导致细胞膜出现去极化效应，诱导na+和ca2+内流，最终导致细胞坏死。同时，ag+易与体内的蛋白质结合，影响人们的代谢和各个器官的正常运作等。
3、目前，重金属离子的检测主要有紫外可见分光光度法、原子荧光光谱法、以及电感耦合等离子体质谱法等，上述方法检测步骤繁琐，成本较高，需要专业的操作人员。因此，研发成本低、检测快、灵敏度高、稳定性好、特异性强的重金属检测探针具有重要意义。
4、荧光探针因其操作简便、选择性好、空间和时间分辨率高、灵敏度高而被广泛应用于金属离子的检测。这些探针在荧光传感、定量分析、生物医学等领域具有重要的应用前景。而近红外（nir）荧光探针由于其较少的背景干扰、更强的组织穿透力和较少的组织损伤而被广泛使用。目前，关于双通道检测hg2+及ag+的小分子近红外荧光探针的研究尚未见报道。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定性强、检测速度快、选择性好、灵敏度和准确性高的用于双通道检测hg2+和ag+的近红外荧光探针及其制备方法和应用。
2、本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于双通道检测hg2+和ag+的近红外荧光探针，所述的近红外荧光探针的化学结构式如下式（i）所示，
3、（i）。
4、本发明还提供上述用于双通道检测hg2+和ag+的近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
5、步骤1、将含pocl3的二甲基甲酰胺溶液和n，n-二羟乙基苯胺混合反应，得到4-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲醛；
6、步骤2、将含乙醇钠的乙醇溶液与巯基乙醇反应后，加入4-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲醛反应完全，经二氯甲烷萃取后，再经饱和食盐水洗涤、干燥剂干燥后进行硅胶柱层析，得到4-(双(2-((2-羟乙基)硫代)乙基)氨基)苯甲醛；
7、步骤3、将2-(1-(9-乙基-9氢-咔唑-3)亚乙基)丙二腈与4-(双(2-((2-羟乙基)硫代)乙基)氨基)苯甲醛混合，以哌啶作为催化剂，反应完全后进行硅胶柱层析，得到用于双通道检测hg2+和ag+的近红外荧光探针，其化学结构式如下述式（i）所示，
8、（i）。
9、进一步，具体步骤如下：
10、步骤1、将5.5～6.5 ml的pocl3缓慢加入到15.5～17.50 ml二甲基甲酰胺中，在0℃下搅拌0.5 h，再加入6～7.5 g n，n-二羟乙基苯胺，在90℃条件下继续反应2.5～3.5 h，反应完成后将反应产物冷却至室温，再倒入纯水中终止反应，用na2co3调节ph至7.0～7.5，过滤，取白色固体沉淀洗涤、烘干和重结晶，得到黄褐色针状晶体，即4-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲醛；
11、步骤2、将0.6～0.8 g乙醇钠加入到20 ml乙醇中，然后加入3～4 ml巯基乙醇，室温下反应1 h后，再加入3.5～4.5 g4-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲醛，继续室温反应1 h后，加热到60℃反应1 h，反应完成后将反应产物倒入纯水中终止反应，加入50～100 ml二氯甲烷进行萃取后，向有机层中加入20 ml饱和食盐水进行洗涤后，取上层有机溶液，向有机溶液中加入10～15 g干燥剂，震荡过滤后去除干燥剂，再采用由石油醚和乙酸乙酯按体积比1:1混合而成的混合液作为层析液，进行硅胶柱层析，在365 nm的紫外灯照射下，收集硅胶柱中具有黄色荧光的溶液，将收集的溶液于50℃旋蒸，得到黄色固体，即4-(双(2-((2-羟乙基)硫代)乙基)氨基)苯甲醛；
12、步骤3、将300～330 mg的2-(1-(9-乙基-9氢-咔唑-3)亚乙基)丙二腈与300～350mg的4-(双(2-((2-羟乙基)硫代)乙基)氨基)苯甲醛混合后加入20 ml乙醇，并滴加300～500 μl哌啶作为反应催化剂，60℃加热回流过夜，反应完成后将反应产物通过孔径为0.22μm的有机过滤膜过滤，将过滤后的溶液进行硅胶柱层析，采用由石油醚和乙酸乙酯按体积比1:1混合而成的混合液作为层析液，在365 nm的紫外灯照射下，取硅胶柱中具有红色荧光的油状液体，即为用于双通道检测hg2+和ag+的近红外荧光探针，其化学结构式如上述式（i）所示。
13、进一步，步骤2中所述的干燥剂为氧化镁、氧化钙、硫酸钙、硫酸铜、硫酸钠和硫酸镁中的任一种。
14、本发明还提供上述近红外荧光探针同时检测ag+和hg2+的方法，包括以下步骤：
15、步骤1、仪器参数设置：设置荧光分光光度计的激发波长为420 nm，发射波段为500～800 nm，光电倍增电压为600 v，夹缝宽度为5 nm，采用四面透光的石英比色皿；
16、步骤2、将近红外荧光探针溶解于由甲醇和hepes缓冲液按体积比（4～5）：（6～5）混合而成的混合溶剂中，得到浓度为10 μmol/l的近红外荧光探针溶液，将近红外荧光探针溶液的ph调为5.5～6.5后，将近红外荧光探针溶液与待测液按体积比9:1的比例混合，反应30s，然后采用荧光分光光度计测定610 nm处的荧光强度，根据荧光强度值与ag+和hg2+总浓度之间的线性关系，计算获得待测液中ag+和hg2+总浓度；
17、步骤3、ag+浓度测定：将步骤2中制备的近红外荧光探针溶液的ph调为7～11后，将近红外荧光探针溶液与待测液按体积比9:1的比例混合，反应30s，然后采用荧光分光光度计测定610 nm处的荧光强度，根据荧光强度值与ag+浓度之间的线性关系，计算获得待测液中ag+浓度；
18、步骤4、hg2+浓度测定：在相同待测液体积下，将待测液中ag+和hg2+的总浓度减去ag+的浓度即为待测液中hg2+浓度。
19、优选的，步骤2中所述的混合溶剂中甲醇和hepes缓冲液的体积比为4.5:5.5。
20、与现有技术相比，本发明的优点在：本发明一种用于双通道检测hg2+和ag+的近红外荧光探针及其制备方法和应用，通过4-(双(2-((2-羟乙基)硫代)乙基)氨基)苯甲醛识别基团发生环化反应制备的近红外荧光探针基本不受环境ph和其他干扰离子的影响，稳定性强；同时，以该识别基团联合2-（1-（9-乙基-9h-咔唑）亚乙基）丙二腈荧光团产生的脱硫效应实现在不同ph条件下对ag+和hg2+的同时测定，且灵敏度高。此外，近红外荧光探针在30s内即可完成ag+和hg2+的检测，检测速度快。近红外荧光探针对hg2+和ag+具有较高的选择性，且能够发生肉眼可见的染色变化，细胞毒性实验表明，该探针对hela细胞的半致死浓度为30 μmol/l，细胞毒性较小，且能够透过细胞膜对细胞内的hg2+进行成像检测。
21、综上所述，本发明一种用于双通道检测hg2+和ag+的近红外荧光探针及其制备方法和应用，利用了酸性条件下hg2+能够与含硫代取代基的基团（如硫代酰胺、硫脲、硫酮等）配位发生脱硫反应，同时利用了ag+与含硫代取代基发生环化反应，实现对hg2+和ag+的同步识别能力，具有稳定性强、检测速度快、选择性好、灵敏度和准确性高的优点。
技术特征：
1.一种用于双通道检测hg2+和ag+的近红外荧光探针，其特征在于所述的近红外荧光探针的化学结构式如下式（i）所示，
2.一种权利要求1所述的用于双通道检测hg2+和ag+的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
3.权利要求2所述的一种用于双通道检测hg2+和ag+的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
4.根据权利要求3所述的一种用于双通道检测hg2+和ag+的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤2中所述的干燥剂为氧化镁、氧化钙、硫酸钙、硫酸铜、硫酸钠和硫酸镁中的任一种。
5.一种利用权利要求1所述的近红外荧光探针同时检测ag+和hg2+的方法，其特征在于包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的近红外荧光探针同时检测ag+和hg2+的方法，其特征在于：步骤2中所述的混合溶剂中甲醇和hepes缓冲液的体积比为4.5:5.5。
技术总结
本发明公开了一种用于双通道检测Hg<supgt;2+</supgt;和Ag<supgt;+</supgt;的近红外荧光探针及其制备方法和应用，特点是探针化学结构式如式（I）所示，其制备方法包括将POCl<subgt;3</subgt;和N，N‑二羟乙基苯胺混合反应，得到4‑(双(2‑氯乙基)氨基)苯甲醛的步骤；将含乙醇钠与巯基乙醇反应后，加入4‑(双(2‑氯乙基)氨基)苯甲醛反应得到4‑(双(2‑((2‑羟乙基)硫代)乙基)氨基)苯甲醛的步骤；最后将2‑(1‑(9‑乙基‑9氢‑咔唑‑3)亚乙基)丙二腈与4‑(双(2‑((2‑羟乙基)硫代)乙基)氨基)苯甲醛混合反应得到用于双通道检测Hg<supgt;2+</supgt;和Ag<supgt;+</supgt;的近红外荧光探针的步骤，优点是稳定性强、检测速度快、选择性好、灵敏度和准确性高。
技术研发人员：史西志,刘华,张泽明,张蓉蓉,尤金杰,孙爱丽
受保护的技术使用者：宁波大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5