玉米ZmER1基因在提高玉米穗腐病抗性中的应用的制作方法

本发明属于基因工程育种及分子育种领域，具体涉及一组snp标记、玉米 zmer1基因及其在提供玉米抗穗腐病抗性中的应用。

背景技术：

1、玉米是世界第一大粮食作物，穗腐病（ear rot）是全球玉米主产区普遍发生的真菌侵染性病害。玉米穗腐病又称玉米穗粒腐病（kernel and ear rot），是世界范围内玉米产区普遍发生的一类真菌侵染性病害，主要致病菌包括拟轮枝镰孢菌（ fusarium  verticillioides, fv）、禾谷镰孢菌（ f. graminearum, fg）以及黄曲霉菌（ aspergillusflavus, af）等，相应穗腐病类型分别为 fusarium ear rot（fer）、 graminearumear rot（ger）以及 aspergillusear rot（aer），其中拟轮枝镰孢菌在世界范围内流行范围最广（logrieco et al. 2002）。大多数病原真菌可分泌真菌毒素，如fv、fg、af分别可分泌伏马毒素、玉米烯酮和黄曲霉毒素等。穗腐病的发生一方面会造成玉米减产,严重威胁全球粮食安全；另一方面穗腐病分泌的真菌毒素会使人类和牲畜器官发生病变，甚至诱发癌症而致死（yang et al. 2020）。据统计，全球玉米生产每年因穗腐病造成的经济损失可达数十亿美元（wu et al. 2012）。此外，当前玉米穗腐病的防治主要以化控为主，化学药剂的大量使用增加了环境污染，也导致碳排放增加（chen et al. 2009）。

2、调控真菌侵染和真菌毒素积累的遗传机制可能存在较大差异，如maschietto等（2017）利用相同遗传群体分别检测到 15个调控fer 的位点和17个调控伏马毒素积累的位点，只有8个位点是二者共有的，表明二者遗传调控基因及调控机制存在显著不同。目前克隆的调控玉米穗腐病抗性基因较少，其中转录因子编码基因还未见报道。

3、类黄酮物质包含多种化合物，其合成和代谢涉及较多物质合成相关基因和调节基因，已有报道多种类黄酮可调节植物生长发育及与微生物的互作等过程（dong and lin,2021; wang et al. 2022）。如类黄酮中橘皮素在水稻中可通过抑制真菌铁死亡从而调控稻瘟病抗病（liang et al. 2021），类黄酮中希诺宁则证明在体外条件下对fv和fg生长具有抑制作用（förster et al. 2022）。在低剂量条件下，芹菜素、木犀草素和槲皮素三种类黄酮物质对af生长和黄曲霉毒素积累具有抑制作用（köllner, 2022）。eqtl（expressedquantitative trait loci）分析则证明黄酮类生物合成途径基因与玉米籽粒af感染具有显著相关性（castano-duque et al. 2022）。利用籽粒颜色差异遗传材料，证明类黄酮色素特别是鞣红具有显著抑制伏马菌素的作用（pilu et al. 2011）。同样利用籽粒颜色差异遗传材料，发现鞣红可以调控玉米籽粒果皮厚度，并抑制伏马菌素的积累（landoni et al.2020）。

4、在玉米中，类黄酮生物合成受到编码r2r3 myb转录因子的 zmp1（ pericarp  color1）基因调控（grotewold等，1994；coe et al. 1988）。 zmp1存在多个等位基因，其等位变异影响玉米果穗色素沉积模式（brinks&styles, 1966; cocciolone et al. 2001），其中对 p1-rr（红色果皮/红色穗轴）、 p1-wr（白色果皮/红色穗轴）、 p1-rw（红色果皮/白色穗轴）和 p1-ww（白色果皮/白色穗轴）等位基因研究较多。比较 zmp1等位位点发现 zmp1存在丰富拷贝数变异，如 p1-rr具有 zm p1单基因拷贝，而 p1-wr则由 zmp1六个拷贝串联重复构成，基因表达差异则主要由 p1-wr相对于 p1-rr的dna高甲基化造成（chopra et al. 1998）。

5、综上所述，前人研究结果表明类黄酮物质含量和真菌毒素积累存在一定联系，但是 zmp1能否直接调控玉米穗腐病抗性还不清楚，尚待进一步研究。

6、本发明利用crispr/cas9（clustered, regularly interspaced, shortpalindromic repeats-associated endonuclease 9）基因编辑技术创制了两种不同突变类型的 zmer1基因敲除突变体 zmer1-1及 zmer1-2。本发明通过人工接种拟轮枝镰孢菌处理野生型和 zmer1突变体，对其穗腐病发病面积分析发现 zmer1基因缺失会导致植株对拟轮枝镰孢菌侵染更加敏感，即玉米 zmer1基因在增强玉米穗腐病抗性能力中发挥重要作用。序列对比发现， zmer1基因与 zmp1基因核苷酸序列高度一致。本发明为玉米抗穗腐病相关基因的挖掘及玉米抗穗腐病新品种的培育提供了新的基因资源。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供玉米抗穗腐病新snp标记snp1-50和新基因 zmer1及其在调控玉米穗腐病抗性中的应用。snp1-50在玉米的第1号染色体的位置如表1所示， zmer1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示， zmer1基因编码的氨基酸序列如seq id no.2所示， zmer1正调控玉米穗腐病抗性。

2、在玉米中利用snp即snp1-50可以通过分子标记辅助选择或全基因组选择出抗穗腐病玉米。

3、在玉米中敲除 zmer1基因会导致玉米对穗腐病胁迫敏感，抗穗腐病能力下降。

4、在 zmer1基因第3个外显子处设计crispr/cas9载体靶点（mt1和mt2)，所述靶点的dna序列如seq id no.3和seq id no.4所示；最终获得两种不同编辑类型的突变体 zmer1-1和 zmer1-2，均表现出穗腐病敏感表型。

5、本发明的目的在于研究 zmer1在玉米穗腐病胁迫中的应用，为抗穗腐病玉米的培育提供新的种质资源。具体技术方案如下：

6、1、抗穗腐病遗传位点鉴定，所述鉴定方法为全基因组关联分析，所利用群体为由ss、nss、pa、pb、tspt亚群材料所组成的1223份玉米自交系。全基因组关联分析所用模型为emmax (efficient mixed-model association expedited)，所取阈值为<1e-10。

7、2、玉米b73 zmer1基因的序列分析，所述 zmer1基因编码的核苷酸序列如seq idno:1所示，所述 zmer1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no:2中所示。选择合适位点进行基因编辑靶点设计。

8、3、构建基因编辑载体，利用农杆菌介导法将基因编辑载体导入玉米自交系x249的愈伤组织中，获得t1代阳性植株后，以人接种拟轮枝镰孢菌至果穗的方法考察其抗穗腐病能力的变化。

9、本发明利用全基因组关联分析方法鉴定出与玉米穗腐病抗性显著关联的snp标记，利用crispr/cas9技术对玉米 zmer1基因第3个外显子进行定点基因编辑，获得了该基因的2种不同编辑类型的突变体，这两种突变体均表现出穗腐病敏感表型，推测 zmer1基因正调控玉米的穗腐病抗性。结果不仅揭示了 zmer1在玉米穗腐病胁迫中的功能，也为抗穗腐病玉米培育提供新的分子标记和基因资源。

10、基于此，本发明鉴定到一组与玉米穗腐病抗性显著关联的snp组合，一个新的与玉米穗腐病抗性相关的 zmer1基因，利用目前基因编辑中应用广泛的crispr/cas9技术，创制玉米 zmer1基因的突变体，并评估其抗穗腐病胁迫的能力，为抗穗腐病玉米的培育提供新的分子标记和基因资源。

技术特征：

1.一组与玉米穗腐病抗性显著相关的snp分子标记在玉米穗腐病抗性分子标记辅助选择或全基因组选择中的应用，其特征在于，所述snp分子标记包括snp1-snp50，其位于玉米的第1号染色体，具体信息如下：（1）碱基位置47833646的snp，类型为a/g；（2）碱基位置47833949的snp，类型为t/g；（3）碱基位置47834083的snp，类型为a/c；（4）碱基位置47834369的snp，类型为a/g；（5）碱基位置47834384的snp，类型为t/c；（6）碱基位置47834515的snp，类型为c/t；（7）碱基位置47834855的snp，类型为c/a；（8）碱基位置47834958的snp，类型为g/a；（9）碱基位置47835040的snp，类型为a/g；（10）碱基位置47835468的snp，类型为t/g；（11）碱基位置47835529的snp，类型为g/t；（12）碱基位置47835695的snp，类型为t/c；（13）碱基位置47835718的snp，类型为g/a；（14）碱基位置47835720的snp，类型为g/t；（15）碱基位置47835858的snp，类型为c/a；（16）碱基位置47835891的snp，类型为g/a；（17）碱基位置47835994的snp，类型为g/c；（18）碱基位置47836112的snp，类型为c/t；（19）碱基位置47836286的snp，类型为g/t；（20）碱基位置47836402的snp，类型为t/c；（21）碱基位置47836763的snp，类型为a/t；（22）碱基位置47836798的snp，类型为c/t；（23）碱基位置47836873的snp，类型为t/a；（24）碱基位置47837201的snp，类型为c/t；（25）碱基位置47854995的snp，类型为c/t；（26）碱基位置47924208的snp，类型为g/a；（27）碱基位置47926447的snp，类型为g/a；（28）碱基位置47926814的snp，类型为g/a；（29）碱基位置48033414的snp，类型为a/g；（30）碱基位置48033453的snp，类型为t/c；（31）碱基位置48033464的snp，类型为g/t；（32）碱基位置48034381的snp，类型为a/c；（33）碱基位置48034462的snp，类型为c/t；（34）碱基位置48034503的snp，类型为g/t；（35）碱基位置48034557的snp，类型为t/c；（36）碱基位置48034585的snp，类型为t/c；（37）碱基位置48034681的snp，类型为g/a；（38）碱基位置48039029的snp，类型为a/g；（39）碱基位置48072690的snp，类型为t/c；（40）碱基位置48074130的snp，类型为g/t；（41）碱基位置48180190的snp，类型为t/c；（42）碱基位置48272315的snp，类型为g/a；（43）碱基位置48338772的snp，类型为a/g；（44）碱基位置48369577的snp，类型为c/t；（45）碱基位置48372189的snp，类型为c/a；（46）碱基位置48389174的snp，类型为a/g；（47）碱基位置48389228的snp，类型为g/a；（48）碱基位置48392075的snp，类型为c/t；（49）碱基位置48392266的snp，类型为c/a；（50）碱基位置48395513的snp，类型为t/g；所述碱基位置是基于已测序玉米自交系b73基因组第5版本，即zm-b73-reference-nam-5.0。

2.zmer1基因在调控玉米穗腐病抗性中的应用，其特征在于，zmer1基因正调控玉米穗腐病抗性，在玉米中抑制zmer1基因的表达和/或活性，会导致玉米对穗腐病敏感，抗穗腐病能力下降；所述zmer1基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，zmer1基因编码蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3.如权利要求 2所述的应用，其特征在于，所述zmer1基因的核苷酸序列包括 seq idno.1所示的核苷酸序列经取代一个或多个核苷酸且编码与seq id no.2相同或至少99％序列同一性氨基酸序列的核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的应用，抑制zmer1基因的方法包括基因编辑、rna干扰。

5.一种创制玉米穗腐病敏感突变体的方法，其特征在于，所述方法为权利要求4所述基因编辑方法，采用crispr/cas9基因编辑技术对zmer1基因进行定点突变，获得穗腐病敏感玉米突变体。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，对玉米zmer1基因第3个外显子处设计crispr/cas9载体靶点mt1和mt2，所述靶点的dna序列如seq id no.3和seq id no.4所示。

7.利用权利要求6所述方法获得的zmer1突变基因zmer1-1和zmer1-2，其特征在于，zmer1-1突变位点在zmer1 cds 序列第433-613 bp碱基处删除181 bp碱基并插入66 bp碱基；zmer1-2突变位点在zmer1 cds 序列第435 bp处有1 bp碱基缺失和在599 bp处有1 bp碱基插入。

技术总结
本发明涉及基因工程育种及分子育种领域，具体公开了抗穗腐病新基因ZmER1及其在调控玉米穗腐病抗性中的应用。ZmER1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过全基因组关联分析鉴定出一组与玉米穗腐病抗性显著相关的SNP分子标记，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点敲除玉米中ZmER1基因创制了两种不同突变类型的基因敲除突变体Zmer1‑1和Zmer1‑2，与野生型相比，突变体的穗腐病抗性均降低，说明ZmER1基因能够正调控玉米穗腐病抗性。本发明为研究玉米抗穗腐病分子机制奠定理论基础，同时为分子设计育种培育具有抗穗腐病特性的玉米优异新种质提供了新的分子标记和基因资源。

技术研发人员：万向元,董振营,尹泽超,安学丽,龙艳,魏珣,李金萍,刘欣洁,田甜,张禹谦,弓晏婉,刘慧娟
受保护的技术使用者：北京中智生物农业国际研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5