一种药敏检测方法

本发明涉及药敏检测分析，具体涉及一种药敏检测方法。

背景技术：

1、最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration，mic）指用肉汤稀释法测定细菌对药物的敏感性时，完全抑制细菌生长的药物最高稀释浓度中1 ml所含的药量，用于表示被测细菌对该药的敏感度。在使用不同种类的药物对不同种类的细菌的进行药敏检测时，由于细菌耐药机制的差异、生长速度的差异和培养条件的差异，判定结果的时间和数学方法不能完全统一，在传统方法中常采用18~24h培养后肉眼判断浊度的情况或紫外吸收所测结果对mic值进行判断，无法在培养过程中即时获得细菌对药物的准确敏感度；因此，现有方法检测时间长，效率低、成本高。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种药敏检测方法。

2、相比于现有分析技术，本发明设计于细菌生长的长时间仪器监测中，通过结合细菌生长曲线和荧光变化趋势，实时数据处理分析，在6 h内给出确定的mic值。

3、本发明的目的至少通过以下技术方案之一实现。

4、一种药敏检测方法，包括以下步骤：

5、（1）设置微孔板：微孔板设置阳性对照孔、阴性对照孔和实验孔，分别以自然数i进行编号；

6、阳性对照孔编号i=0；

7、实验孔以1~n的正整数依次编号，分别为i=1、i=2、……、i=n；

8、阴性对照孔编号i=n+1；

9、其中，n为大于2的正整数；

10、阳性对照孔、阴性对照孔和实验孔均含有相同浓度的荧光染料，阳性对照孔和实验孔还含有相同浓度的细菌，实验孔还含有药物，实验孔的药物浓度按编号i=1、i=2、……、i=n依次梯度增加；

11、（2）培养微孔板，定时收集荧光信号并分析数据；

12、分析数据的步骤如下：

13、步骤一，

14、令微孔板反应时间t=0h；

15、步骤二，

16、测得t时刻各i孔的荧光值ft,i；

17、t时刻各i孔的相对生长荧光值为kt,i；

18、其中，t时刻实验孔的相对生长荧光值为kt,i=ft,i/ft,i-1，i=1、i=2、……、i=n，

19、t时刻阳性对照孔的相对生长荧光值为kt,0=ft,0/ft,0=1，

20、t时刻阴性对照孔的相对生长荧光值为kt,n+1=ft,n+1/ft,n；

21、步骤三，

22、将t时刻各i孔的相对生长荧光值kt,i与0.85比较大小，同一时刻出现kt,i≤0.85的微孔数目为n；

23、步骤四，

24、当n=0时， t=t+（0.2~0.5）h，返回步骤二，进行下一个时间点的分析；

25、当n=1时，取小于等于0.85的kt,i赋值为最小值kmin，即kmin=kt,i；

26、当n≥2时，取所有小于等于0.85的kt,i比较i值，imax为其中最大值；如果imax=n+1，则kmin=kt,n+1；如果imax≠n+1，则取kt,imax+1与0.98相比较；如果kt,imax+1≥0.98，则将kt,imax赋值为最小值kmin，即kmin=kt,imax；如果kt,imax+1＜0.98且kt+0.25,imax+1＜kt,imax+1，则将kt,imax+1赋值最小值kmin，即kmin=kt,imax+1；如果kt,imax+1＜0.98且kt+0.25,imax+1≥kt,imax+1，则令t=t+（0.2~0.5）h，返回步骤二，进行下一个时间点的分析；

27、得到kmin后终止数据收集；

28、步骤五，

29、分析kmin对应的i值，如果i=2~n，报告mic值=【i孔对应的药物浓度】；如果i=1，报告mic值≤【i=1孔对应的药物浓度】；如果i=n+1，报告mic值＞【i=n孔对应的药物浓度】。

30、优选的，微孔板各孔的检测液体积相等。

31、优选的，所述荧光染料为aie荧光染料；所述aie荧光染料包括aie-1分子，所述aie-1分子选自式1中的至少一种；

32、

33、式1

34、式1中，r各自独立选自氢、氨基、具有1～20个碳原子的烷基、具有2～20个碳原子的不饱和烃基、具有1～20个碳原子的杂烷基、具有3～20个碳原子的环烷基、具有2～20个碳原子的杂环烷基、具有6～30个碳原子的芳基和具有5～30个碳原子的杂芳基；

35、r1选自以下结构中的一种：

36、

37、

38、z为阴离子；

39、r2选自以下结构中的一种：

40、

41、n1为1-5的整数。

42、进一步优选的，所述aie荧光染料还包括aie-2分子，所述aie-2分子选自式2中的至少一种；

43、

44、式2

45、式2中，r1、r2、r3、r4、r5各自独立的选自取代或未取代的具有1～20个碳原子的直链烷基、取代或未取代的具有3～20个碳原子的支链烷基、取代或未取代的具有3～20个碳原子的环烷基；

46、n2为2-10的整数；

47、x-为阴离子。

48、更优选的，所述aie荧光染料中aie-1分子与aie-2分子的摩尔比为1：（5~10）。

49、进一步优选的，aie-1分子选自以下一种：

50、

51、aie-2分子选自以下一种：

52、。

53、优选的，荧光染料的终浓度为5~12μm。

54、优选的，细菌为金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、mrsa、屎肠球菌、无乳链球菌、化脓链球菌、沙雷氏菌或嗜麦芽窄食单胞菌。

55、优选的，细菌的终浓度为0.5麦氏浊度~0.5麦氏浊度稀释1000倍之间的任意浓度；进一步优选为0.5麦氏浊度稀释100~500倍之间的任意浓度。

56、优选的，药物为左氧氟沙星、头孢他啶、氨苄西林、亚胺培南、头孢呋辛、庆大霉素、四环素、哌拉西林/他唑巴坦或复方新诺明，药物的浓度梯度参照clsi标准设置。

57、优选的，n为3~20的正整数（3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20）。

58、优选的，培养的温度为28~37℃。

59、优选的，荧光信号的激发波长460nm，发射波长560nm。

60、优选的，监测时间间隔为0.20~0.50h。

61、进一步优选的，监测时间间隔为0.25~0.50h。

62、优选的，将mic值与clsi标准中敏感、中介、耐药的折点进行比较，并输出报告。

63、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

64、本发明基于细菌生长特点，利用荧光判读的优势，实现实时监测分析，能更快的获取药敏结果，及时终止监测，时间短、效率高；并且对设备要求低，用常用的具有发光检测功能的多功能读板机就能实现监测分析。

技术特征：

1.一种药敏检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的药敏检测方法，其特征在于，所述荧光染料为aie荧光染料；所述aie荧光染料包括aie-1分子，所述aie-1分子选自式1中的至少一种；

3.根据权利要求2所述的药敏检测方法，其特征在于，所述aie荧光染料还包括aie-2分子，所述aie-2分子选自式2中的至少一种；

4.根据权利要求3所述的药敏检测方法，其特征在于，所述aie荧光染料中aie-1分子与aie-2分子的摩尔比为1：（5~10）。

5.根据权利要求3所述的药敏检测方法，其特征在于，aie-1分子选自以下一种：

6.根据权利要求1所述的药敏检测方法，其特征在于，细菌为金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、mrsa、屎肠球菌、无乳链球菌、化脓链球菌、沙雷氏菌或嗜麦芽窄食单胞菌；药物为左氧氟沙星、头孢他啶、氨苄西林、亚胺培南、头孢呋辛、庆大霉素、四环素、哌拉西林/他唑巴坦或复方新诺明。

7.根据权利要求1所述的药敏检测方法，其特征在于，荧光染料的终浓度为5~12μm；细菌的终浓度为0.5麦氏浊度~0.5麦氏浊度稀释1000倍之间的任意浓度；药物的浓度梯度参照clsi标准设置。

8.根据权利要求1所述的药敏检测方法，其特征在于，n为3~20的正整数。

9.根据权利要求1所述的药敏检测方法，其特征在于，培养的温度为28~37℃；荧光信号的激发波长460nm，发射波长560nm。

10.根据权利要求1所述的药敏检测方法，其特征在于，将mic值与clsi标准中敏感、中介、耐药的折点进行比较，并输出报告。

技术总结
本发明公开了一种药敏检测方法，包括设置微孔板、培养微孔板和定时收集荧光信号并分析数据。本发明基于细菌生长特点，利用荧光判读的优势，实现实时监测分析，能更快的获取药敏结果，及时终止监测，时间短、效率高；并且对设备要求低，用常用的具有发光检测功能的多功能读板机就能实现监测分析。

技术研发人员：唐本忠,谭妙英,何柳,王志明,刘勇,龚晚君
受保护的技术使用者：广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5