一种基于多聚核苷酸的低免疫原性AAV基因治疗载体及其制备方法和应用与流程
本发明涉及基因治疗领域，具体涉及一种基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治疗载体及其制备方法和应用。
背景技术：
1、基因治疗是一种治疗遗传性疾病、癌症及其它难治性疾病的有效手段，其中，腺相关病毒（aav）载体因其高效、稳定的特点成为常用的基因治疗工具。但aav载体在体内应用时常引发免疫反应，导致治疗效果受限，因此，通常需要对aav载体进行修饰处理，以减少免疫反应。现有的修饰技术存在诸多不足，如使用免疫抑制剂，往往存在副作用大，降低治疗效果，得到的aav载体免疫原性仍然很高，免疫反应减少程度小，载体在宿主体内的稳定性和持续表达能力差等问题。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治疗载体及其制备方法和应用。
2、本发明的目的之一在于提供一种基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治疗载体，包括编码治疗性蛋白的转基因、修饰后的多聚核苷酸、低免疫原性的aav衣壳蛋白和至少一个免疫调节模块；
3、所述转基因被置于aav的反向末端重复序列之间，并连接至强启动子和多聚腺苷酸化信号；
4、所述修饰包括但不限于5-甲基胞嘧啶修饰；
5、所述免疫调节模块包括但不限于mirna或shrna序列，所述免疫调节模块用于抑制体内免疫应答的关键因子。
6、优选的，还包括rna编辑技术，所述rna编辑技术用于选择性修饰rna。
7、优选的，所述rna编辑技术为crispr/cas13。
8、优选的，所述低免疫原性的aav衣壳蛋白选自aav5、aav8或aav9的野生型或其经过改造的变体。
9、优选的，所述免疫调节模块还包括免疫检查点抑制剂的表达，免疫检查点抑制剂为pd-1阻断肽或pd-l1阻断肽。
10、优选的，低免疫原性aav基因治疗载体还包括转录后调节元件，所述转录后调节元件为土拨鼠肝炎病毒转录后元件（wpre）。
11、优选的，低免疫原性aav基因治疗载体还包括一个增强载体稳定性的化学添加剂，所述化学添加剂为tween20或蔗糖。
12、本发明的目的之二在于提供一种低免疫原性aav基因治疗载体的制备方法，包括以下步骤：
13、(a)克隆至表达载体：通过限制性内切酶消化或无缝克隆技术将修饰后的多聚核苷酸、编码治疗性蛋白的转基因（含强启动子和多聚腺苷酸化信号）、转录后调节元件和aav衣壳蛋白克隆至表达载体中，限制性内切酶为ecori和/或noti；
14、(b)病毒包装：在hek293细胞系或其衍生物中使用lipofectamine进行转染及病毒包装，转染比例为1:2（质粒:转染试剂），转染时间24h；
15、(c)纯化：通过密度梯度离心或/和亲和层析纯化得到所需的低免疫原性aav基因治疗载体。
16、优选的，所述(c)中的层析纯化使用商业化试剂盒进行超滤纯化，商业化试剂盒包括amicon ultra-15超滤管，所述amicon ultra-15超滤管的截留分子量为100 kda。
17、本发明目的之三在于提供一种低免疫原性aav基因治疗载体在制备治疗遗传性疾病、癌症或其它需要长期基因表达疾病的药物中的应用。
18、本发明的有益效果为：
19、1、本发明通过多聚核苷酸修饰和免疫调节模块，减少免疫反应，提高aav基因治疗载体在宿主体内的稳定性和持续表达能力；其中，通过化学修饰（5-甲基胞嘧啶修饰），减少免疫刺激，提高rna的稳定性和翻译效率；通过引入mirna或shrna序列抑制体内免疫应答的关键因子，并表达免疫检查点抑制剂（pd-1/pd-l1阻断肽），调节局部免疫环境，减少免疫反应，减少治疗过程中因免疫反应导致的副作用，提高载体在宿主体内的稳定性和持续表达能力，从而在保证治疗效果的同时提高安全性。
20、2、本发明通过选择aav衣壳蛋白，具体的，通过选择经过验证的aav5、aav8或aav9的野生型或其经过改造的变体，提高组织靶向性和/或穿透血脑屏障的能力，提高载体在特定组织中的转导效率，使得载体能够更有效地到达目标组织，提高治疗效果。
21、3、本发明通过转录后调节元件，能够增强mrna的稳定性和翻译效率，提高治疗性蛋白的表达水平，如使用wpre转录后调节元件，可以显著增强mrna的稳定性和翻译效率，从而提高转基因的表达水平，增强治疗性蛋白的表达水平，提高治疗效果的一致性和持久性。
技术特征：
1.一种基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治疗载体，其特征在于，包括编码治疗性蛋白的转基因、修饰后的多聚核苷酸、低免疫原性的aav衣壳蛋白和至少一个免疫调节模块；
2.根据权利要求1所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治疗载体，其特征在于，还包括rna编辑技术，所述rna编辑技术用于选择性修饰rna。
3.根据权利要求1所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治疗载体，其特征在于，所述低免疫原性的aav衣壳蛋白选自aav5、aav8或aav9的野生型或其经过改造的变体。
4.根据权利要求1所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治疗载体，其特征在于，所述免疫调节模块还包括免疫检查点抑制剂的表达，免疫检查点抑制剂为pd-1阻断肽或pd-l1阻断肽。
5.根据权利要求1所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治疗载体，其特征在于，还包括转录后调节元件，所述转录后调节元件为土拨鼠肝炎病毒转录后元件。
6.根据权利要求2所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治疗载体，其特征在于，所述rna编辑技术为crispr/cas13技术。
7.根据权利要求1所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治疗载体，其特征在于，还包括化学添加剂，所述化学添加剂为tween20或蔗糖。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治疗载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治疗载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中的层析纯化使用商业化试剂盒进行超滤纯化，商业化试剂盒包括amicon ultra-15超滤管，所述amicon ultra-15超滤管的截留分子量为100 kda。
10.一种如权利要求1-7所述的基于多聚核苷酸的低免疫原性aav基因治疗载体在制备治疗遗传性疾病、癌症或其它需要长期基因表达疾病的药物中的应用。
技术总结
本发明涉及基因治疗领域，具体涉及一种基于多聚核苷酸的低免疫原性AAV基因治疗载体及其制备方法和应用，所述载体包括编码治疗性蛋白的转基因、修饰的多聚核苷酸、低免疫原性的AAV衣壳蛋白、免疫调节模块；转基因被置于AAV的反向末端重复序列之间；低免疫原性的AAV衣壳蛋白选自AAV5、AAV8或AAV9的野生型或其经过改造的变体；免疫调节模块包括miRNA或shRNA序列。本发明通过多聚核苷酸修饰和免疫调节模块，减少免疫反应，提高AAV基因治疗载体在宿主体内的稳定性和持续表达能力；通过选择AAV衣壳蛋白，提高载体在特定组织中的转导效率，使得载体能够更有效地到达目标组织。
技术研发人员：董书萍,贺君
受保护的技术使用者：瑞吉明（山东）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5