一种高磷脂细胞培养鱼油及其制备方法

本发明涉及生物工程，具体涉及一种高磷脂细胞培养鱼油及其制备方法。

背景技术：

1、鱼油，从鱼类及其加工副产品中提取，富含epa、dha、亚麻酸和亚油酸等多不饱和脂肪酸，但磷脂含量较少。鱼油对多种疾病有特殊的预防和治疗作用，如代谢综合征、心脑血管疾病、炎症等。但鱼油在加工过程中容易氧化，不仅会影响风味、色泽和口感，还会降低营养价值。随着海洋污染的日益严重，直接从海洋鱼类中提取的鱼油也往往含有多种污染物，严重影响了鱼油的加工和安全。因此，寻找新的高磷脂鱼油生产方法迫在眉睫。

2、细胞培养肉是近年来兴起的一种颠覆性食品制造技术，旨在利用干细胞和组织工程学在体外大规模培养细胞，用于生产农产品。目前，细胞培养脂肪主要用于哺乳动物细胞，如鸡、猪和牛，而关于使用鱼类细胞的研究报道很少。目前用于培养脂肪的细胞类型有去分化脂肪细胞、脂肪来源干细胞、前脂肪细胞、多能干细胞等。然而，它们的成脂效率和增殖能力会随着传代次数的增加而降低，这大大限制了它们在细胞培养脂肪和大规模生产中的应用。因此，选择稳定的养殖肉类种子细胞系（如肌肉干细胞）就成了生产优质细胞鱼油的关键。鱼细胞系容易自发永生化，这是其作为种子细胞的最大优势。研究表明，体细胞和肌肉卫星细胞有可能在特定条件下转分化为脂肪细胞或类脂肪细胞。通过转分化策略，可以实现高效稳定的细胞增殖和对细胞脂质组成精准的分化控制。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是目前缺乏合适的鱼细胞成脂转分化培养基及大规模制备高磷脂含量的细胞培养鱼油的方法，严重阻碍了细胞鱼肉及其衍生制品的发展。

2、为解决上述问题，本发明通过调整成脂转分化培养基，实现了大黄鱼肌肉卫星细胞快速成脂转分化，并大规模制备了高磷脂含量的细胞培养大黄鱼鱼油，为进一步的得到细胞培养鱼肉奠定了基础。另外，本发明通过添加油酸、葡萄糖和维生素c以及物理调控（培养体系优化）共同实现了制备高磷脂含量的细胞培养鱼油，进一步改良了鱼油的营养品质。

3、为实现上述目的，本使用发明的技术方案是：一种高磷脂细胞培养鱼油的制备方法，包括以下步骤：使用完全培养基扩增肌肉细胞，再使用成脂转分化培养基行成脂转分化诱导，得到高磷脂细胞培养鱼油；

4、其中，成脂转分化培养基由85-94%（ v/v）dmem/f12、3-12%（ v/v）马血清、1%（ v/v）青霉素-链霉素（100x）、1%（ v/v）非必需氨基酸、1%（ v/v）glutamax™、0.25-1.5 μm地塞米松、5-25 μm罗格列酮、2.5-15 μg/ml胰岛素、25-125 μm吲哚美辛、125-750 μm ibmx、50-500 μm油酸、1-5 mm l-谷氨酰胺、50-250 μm 维生素c、20-100 μm葡萄糖组成；分化时间为4-6天。

5、其中，dmem/f12为基础培养基，为细胞提供基本营养；马血清中含有血清蛋白、生长因子、氨基酸、糖类、无机盐等物，可为细胞提供基本营养和能量，马血清不如胎牛血清营养丰富，且马血清中含有一些激素、因子可以引导细胞向特定的细胞类型分化；青霉素-链霉素（100x）可防止微生物污染；非必需氨基酸为细胞增殖及分化提供营养；glutamax™、l-谷氨酰胺可为细胞提供能量和氮源，改善细胞健康；地塞米松是一种人工合成的糖皮质激素，促进c/ebps表达；罗格列酮为胰岛素增敏剂，可激活pparγ；胰岛素可以激活creb及下游一系列转录激活因子，促进游离脂肪酸合成甘油三酯；吲哚美辛可阻断细胞向破骨及成骨细胞方向分化，pparγ激活剂；ibmx可激活camp依赖性蛋白激酶途径来增强c/ebps和pparγ的表达；油酸可以作为pparγ的天然激活配体；维生素c可以上调脂肪形成相关基因pparγ、维甲酸x受体α、脂蛋白酯酶等转录水平，还可以促进胶原蛋白合成、上调lpl和gpdh的表达，下调脂联素的表达，促进甘油三酯积累，加速细胞分化进程；葡萄糖通过糖酵解为细胞提供能量和碳源。

6、进一步的，所述肌肉细胞为大黄鱼肌肉卫星细胞。相比去分化脂肪细胞、脂肪来源干细胞、前脂肪细胞、多能干细胞等其他用于成脂的细胞，肌肉卫星细胞更容易获得，且其成脂效率和增殖能力不会因随着传代次数的增加而降低。

7、进一步的，完全培养基为含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素（100x）的dmem/f12培养基。dmem/f12由dmem和f-12按1:1比例混合而成，结合了两种培养基的优点，使培养基的营养更加全面，可为细胞生长和增殖提供基本能量和营养。胎牛血清为细胞生长提供所需的各种生长因子、激素、蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质和微量元素等，可促进细胞的增殖、分化和维持正常生理功能。细胞在10%胎牛血清中可维持正常的细胞形态及增殖效率，胎牛血清浓度过低，细胞增殖速率下降，形态变差，容易空泡，浓度过高则增加成本，且容易促使细胞分化。

8、进一步的，2d成脂转分化包括以下步骤：将肌肉细胞接种到6孔板中，加入完全培养基，待细胞长满后更换为成脂转分化培养基，进行分化。

9、进一步的，3d成脂转分化包括以下步骤：

10、（1）将微载体加入到内置叶轮培养瓶中，加入基础培养基，搅拌溶胀；

11、（2）静置后弃掉上层基础培养基，加入基础培养基再次搅拌，静置后弃掉上层基础培养基；

12、（3）加入完全培养基，按一定密度接种细胞，梯度搅拌过夜；第二天补加培养基至500 ml，调整为恒速搅拌，隔天半换液；

13、（4）待细胞长满微载体后，静置弃掉完全培养基，加入转分化培养基，隔天半换液；

14、（5）静置弃掉转分化培养基，收集样品，用pbs洗涤两次，加入细胞裂解液，离心，收集上清。

15、进一步的，步骤（1）中微载体的加入比例为按总培养体系的体积计2-5 mg/ml；溶胀时间为12 h。提前将微载体溶胀后有利于细胞贴附增殖。

16、进一步的，步骤（1）和步骤（2）中的基础培养基为dmem/f12培养基，添加量为50-100 ml；搅拌速度为40 rpm。尽可能洗去微载体中可能残留的对细胞有影响的物质。与完全培养基中的基础培养基保持一致，防止引入外源杂质。

17、进一步的，步骤（3）加入200 ml完全培养基，接种肌肉细胞的密度为5-20万/ml。细胞接种密度过低，细胞增殖缓慢，状态差，培养时间长；接种密度过高，细胞生长受限，细胞之间竞争加剧，影响细胞的生长和增殖，且会降低微载体的利用效率。

18、进一步的，步骤（3）中梯度搅拌程序为0 rpm，2 h，40 rpm，5 min，循环过夜；恒速搅拌速度为40 rpm。肌肉卫星细胞的贴壁时间在2 h左右，静置2 h可促使细胞贴附在微载体上；40 rpm搅拌对对细胞基本没有剪切应力损伤，通过搅拌，可使细胞贴附更加均匀。

19、进一步的，步骤（5）中细胞裂解时间为2-3 min，室温操作；离心时间为5 min，转速5000 rpm。微载体在裂解液中处理2-3 min可使细胞脱离微载体，通过离心，可将微载体沉于底部，而细胞留在在上清中，便于收集。

20、一种上述方法制备的高磷脂细胞培养鱼油。所得细胞培养鱼油中脂质总量为768.8 mg/g，其中甘油三酯占比46.35%，磷脂占比52.38%，而实际提取鱼油中脂质总量为680.37 mg/g，磷脂占比29.17%，甘油三酯占比66.75%，两者相比，细胞培养鱼油中磷脂含量增加1.80倍。

21、本发明的有益效果为：

22、（1）通过优化转分化培养基可以实现大黄鱼肌肉卫星细胞快速成脂转分化，利用微载体实现大规模细胞培养鱼油的制备，为后续细胞培养脂肪及细胞培养肉的制备奠定基础。

23、（2）本发明通过添加油酸、葡萄糖和维生素c以及物理调控（培养体系优化）共同实现了制备高磷脂含量的细胞培养鱼油，进一步改良了鱼油的营养品质。

技术特征：

1.一种高磷脂细胞培养鱼油的制备方法，其特征在于包括以下步骤：使用完全培养基扩增肌肉细胞，再使用成脂转分化培养基行成脂转分化诱导，得到高磷脂细胞培养鱼油；

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述肌肉细胞为大黄鱼肌肉卫星细胞。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：完全培养基为含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素（100x）的dmem/f12培养基。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于2d成脂转分化包括以下步骤：将肌肉细胞接种到6孔板中，加入完全培养基，待细胞长满后更换为成脂转分化培养基，进行分化。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于3d成脂转分化包括以下步骤：

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：骤（1）中微载体的加入比例为按总培养体系的体积计2-5 mg/ml；溶胀时间为12 h；步骤（1）和步骤（2）中的基础培养基为dmem/f12培养基，搅拌速度为40 rpm。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）加入200 ml完全培养基，接种肌肉细胞的密度为5-20万/ml。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中梯度搅拌程序为0 rpm，2 h，40 rpm，5 min，循环过夜；恒速搅拌速度为40 rpm。

9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（5）中细胞裂解时间为2-3 min，室温操作；离心时间为5 min，转速 5000 rpm。

10.一种权利要求1-9任一所述制备方法制备的高磷脂细胞培养鱼油。

技术总结
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种高磷脂细胞培养鱼油及其制备方法。包括以下步骤：首先在2D条件下扩增细胞，然后将其接种在微载体上进行大体系培养，待细胞长满后进行成脂转分化诱导，诱导4天即可实现大黄鱼肌肉卫星细胞成脂转分化诱导。本发明通过调整成脂转分化培养基，实现了大黄鱼肌肉卫星细胞快速成脂转分化，并大规模制备了高磷脂含量的细胞培养大黄鱼鱼油，为进一步的得到细胞培养鱼肉奠定了基础。另外，本发明通过添加油酸、葡萄糖和维生素C以及物理调控（培养体系优化）共同实现了制备高磷脂含量的细胞培养鱼油，进一步改良了鱼油的营养品质。

技术研发人员：郑洪伟,薛长湖,魏迎新,许维娜,冯婷玉,王明昊
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5