一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法和应用
本申请涉及生物荧光检测，更具体地，涉及一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法和应用。
背景技术：
1、碱性磷酸酶（alp)是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织，经肝脏向胆外排出的一种酶。参与生命活动的多个方面，包括代谢、分子运输、信号转导和遗传信息的表达。alp的下调与许多疾病有关，alp主要用于骨骼、肝胆系统疾病的诊断和鉴别诊断。因此，发展一种灵敏的、选择性高的方法定量检测血清中alp 水平是极其重要的。
2、目前已有荧光法、电化学法、比色法、表面增强拉曼散射法、化学发光法等多种方法用于监测alp活性，其中，电化学法和表面增强拉曼散射建立完好但步骤复杂，传统的比色法抗干扰能力低，灵敏度较低。与其相比，荧光法通常具有背景干扰低、灵敏度高、抗干扰能力强的特点。因此，alp活性检测的主要进展集中在荧光策略的设计上。由于分析物通常不发荧光，因此必须将适当的荧光物质引入分析系统。这些荧光物质在荧光分析中起着核心作用，例如有机染料、纳米材料等。
3、参与 alp荧光测定的有机染料通常是小分子且结构多样。检测alp活性探针的设计方法一般是将一个小分子荧光团的羟基进行磷酸化，磷酸化后的荧光团没有荧光信号或具有弱荧光信号，当alp存在时候，磷酸基团被除去，荧光团又恢复。但是现有的荧光底物受ph的影响较大，在肿瘤的软酸环境中无法进行灵敏的检测；荧光物质的斯托克斯位移较小，导致较高的背景干扰；荧光检测时间较长，不利于提高检测效率；荧光检测得到的荧光强度较弱。
技术实现思路
1、提供了本申请以解决现有技术中存在的上述缺陷。需要一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法和应用，能够减小ph对荧光检测的影响，能够在肿瘤的软酸环境下提高检测的灵敏性，斯托克斯位移大，还能够缩短检测时间，提高荧光强度的稳定性。
2、本申请的第一方面，提供了一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，所述荧光检测方法包括：底物与待测液混合，所述底物中包括1-萘磷酸钠，反应生成萘酚，并得到混合溶液a；混合溶液a与乙二胺混合，反应后得到混合溶液b；利用荧光光谱仪对混合溶液b在355nm光波长的激发下产生的荧光进行荧光检测，得到待测液中的碱性磷酸酶的浓度。
3、本申请的第二方面，提供了一种本申请任一实施例所述的荧光检测方法在检测细胞、血清和/或器官中的碱性磷酸酶活性中的应用。
4、本申请各个实施例提供的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法和应用，利用1-萘磷酸钠作为底物，与待测液混合，待测液中的碱性磷酸酶与1-萘磷酸钠反应生成萘酚，萘酚与乙二胺反应后在355nm光波长的激发下，能够得到较高的荧光强度，碱性磷酸酶浓度和荧光强度符合线性规律，便于进行荧光检测；检测过程中的反应时间较短，能够缩短检测时间，更为重要的是以1-萘磷酸钠作为底物，得到的荧光底物能够适应不同的ph条件，使其能够用于检测肿瘤细胞、血清和器官中的碱性磷酸酶活性，在肿瘤细胞等软酸环境下，仍然能够产生较强的荧光强度；以1-萘磷酸钠作为底物，检测结果的斯托克斯位移大、背景干扰低、对生物样品的光损伤小、样品穿透性强、检测灵敏度高。
技术特征：
1.一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，其特征在于，所述荧光检测方法包括：底物与待测液混合，所述底物中包括1-萘磷酸钠，反应生成萘酚，并得到混合溶液a；混合溶液a与乙二胺混合，反应后得到混合溶液b；利用荧光光谱仪对混合溶液b在355nm光波长的激发下产生的荧光进行荧光检测，得到待测液中的碱性磷酸酶的浓度。
2.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，利用荧光光谱仪对混合溶液b在355nm光波长的激发下产生的荧光进行荧光检测，得到待测的碱性磷酸酶的活性，包括：利用荧光光谱仪对混合溶液b在355nm光波长的激发下产生的荧光进行荧光检测，得到荧光光谱；基于所述荧光光谱，得到479nm的荧光强度；基于所述479nm的荧光强度和碱性磷酸酶活性的线性关系，得到碱性磷酸酶的活性。
3.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，所述底物包括1-萘磷酸钠溶液，所述1-萘磷酸钠溶液中1-萘磷酸钠的浓度为200-600μmol/l；1-萘磷酸钠溶液与待测液的体积比为1-4:1。
4.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，混合溶液a与乙二胺溶液混合后反应，混合溶液a与乙二胺溶液的体积比为5-40:1；乙二胺溶液的体积分数为40-60%；混合溶液b中的乙二胺的体积分数为1-15%。
5.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，1-萘磷酸钠与待测液混合的反应时间为5-80min;混合溶液a与乙二胺混合反应的时间为5-100min。
6.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，待测液中碱性磷酸酶的浓度范围为0-800mu/ml。
7.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，所述底物中还包括混合溶液d，所述混合溶液d中包括mgcl2和tris-hcl缓冲液。
8.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，底物与待测液混合反应的温度为30-40℃；混合溶液a与乙二胺混合反应的温度为30-40℃。
9.权利要求1-8任一项所述的荧光检测方法在检测细胞、血清和/或器官中的碱性磷酸酶活性中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细胞包括肿瘤细胞和/或正常细胞。
技术总结
本申请实施例涉及一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法和应用，所述荧光检测方法包括：底物与待测液混合，所述底物中包括1‑萘磷酸钠，反应生成萘酚，并得到混合溶液A；混合溶液A与乙二胺混合，反应后得到混合溶液B；利用荧光光谱仪对混合溶液B在355nm光波长的激发下产生的荧光进行荧光检测，得到待测液中的碱性磷酸酶的浓度，因此本申请的荧光检测方法能够减小pH对荧光检测的影响，能够在肿瘤的软酸环境下提高检测的灵敏性，斯托克斯位移大，还能够缩短检测时间，提高荧光强度的稳定性。
技术研发人员：孔维恒,马一凡,赵岩,王凯
受保护的技术使用者：曲阜师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5