一种FCGR3A基因修饰的非人动物的制作方法

本发明提供一种表达人或人源化(例如，人源化)fcgr3a蛋白的非人动物及其使用方法。

背景技术：

1、传统的药物研发通常使用体外筛选方法，然而这些筛选方法无法提供机体环境(如肿瘤微环境、基质细胞、细胞外基质成分和免疫细胞相互作用等)，导致药物开发失败率较高。此外，鉴于人与动物之间的差异，使用常规实验动物进行体内药理试验获得的试验结果可能无法反映真实的疾病状态和靶向部位的相互作用，导致许多临床试验的结果与动物实验结果存在显著差异。

2、因此，开发适合人抗体筛选和评价的人源化动物模型将显著提高新药开发效率，降低药物研发成本。

3、但是，人源化动物模型的构建十分困难，例如非专利文献：generation andutility of genetically humanized mouse models(scheer n，snaith m，wolf cr，seib1er j.，drug discovery today；18(23-24)：1200-11，2013)公开了任何基因的人源化都带有一定的风险，即便采用精心设计的策略也无法确保人基因在动物体内的表达及其功能。

技术实现思路

1、本技术提供一种具有人或人源化fcgr3a蛋白的动物模型。该动物模型可以表达人或人源化fcgr3a(如，人源化fcgr3a)蛋白。它可用于fcgr3a基因功能的研究，还可用于fcgr3a信号通路调节剂(例如，抗fcgr3a抗体、寡核苷酸药物和/或多肽药物)的筛选和评估。此外，通过本技术所述方法制备的动物模型可用于药物筛选、药效学研究、免疫疾病的治疗和人fcgr3a靶位点的疾病治疗；该模型还可以用于促进新药开发和设计，节省时间和成本。综上所述，本发明为研究fcgr3a蛋白的功能提供了强有力的工具，为筛选相关药物提供了平台。

2、在一方面，本发明提供了一种基因修饰的非人动物或其构建方法，所述非人动物的基因组包含至少一条染色体，所述染色体包含编码人或人源化fcγ受体iiia(fcgr3a)蛋白的核苷酸序列。在一些实施例中，所述编码人或人源化fcgr3a蛋白的核苷酸序列可操作地连接至至少一条染色体的内源fcgr4基因座的调控元件(如，人或非人动物内源的启动子、5'utr和/或3'utr)。在一些实施例中，所述编码人或人源化fcgr3a蛋白的核苷酸序列的表达通过调控元件调控，所述的调控元件优选为人或非人动物内源的调控元件(如，人或非人动物内源的启动子、5'utr和/或3'utr)。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a蛋白包含人或人源化的胞外区、人或人源化的跨膜区和非人动物的胞质区。在一些实施例中，所述的人源化fcgr3a蛋白还包含人或非人动物的信号肽。在一些实施例中，所述人或人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列包含seq id no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no：35或seq idno：35第1-229位；或包含与seq id no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no：35或seqid no：35第1-229位同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列包含seq id no：1或seq id no：1第225-249位；或包含与seq id no：1或seq id no：1第225-249位氨基酸同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列包含seq id no：7或seq id no：33；或，包含与seq id no：7或seq id no：33同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些实施例中，所述非人动物包括哺乳动物，如猴子或啮齿动物。在一些实施例中，所述的啮齿动物包括小鼠或大鼠。在一些实施例中，所述非人动物是小鼠。在一些实施例中，所述非人动物内源fcgr4蛋白不表达或与野生型动物中fcgr4相比表达水平降低。在一些实施例中，所述非人动物的一个或多个细胞表达人或人源化fcgr3a蛋白。

3、在一方面，本发明提供了一种基因修饰的非人动物或其构建方法，在非人动物内源fcgr4基因座处，用包含人或人源化fcgr3a的核苷酸序列替换非人动物内源fcgr4基因。在一些实施例中，非人动物内源fcgr4基因的外显子1-5的全部或部分被替换。在一些实施例中，被替换的非人动物内源fcgr4基因还包含非人动物内源fcgr4基因的5’utr上游至少50bp连续核苷酸序列和/或3’utr下游至少50bp连续核苷酸序列。在一些实施例中，被替换的非人动物内源fcgr4基因包含内源5’utr上游至少6764bp，优选的，所述核苷酸序列还包含内源3’utr下游至少872bp连续核苷酸。在一些实施例中，所述非人动物的一个或多个细胞表达人或人源化fcgr3a，所述人或人源化fcgr3a包含胞外区、跨膜区和胞质区，所述胞外区和/或跨膜区与人fcgr3a胞外区和/或跨膜区一致或同一性至少为50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，所述胞外区和/或跨膜区与人fcgr3a胞外区和/或跨膜区至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个连续氨基酸一致。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含人fcgr3a基因的部分。在一些实施例中，所述人fcgr3a基因的部分可以为基因组dna序列、cds或cdna序列。在一些实施例中，所述人fcgr3a基因的部分包含人fcgr3a基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5的全部和/或外显子6的部分，优选的，人fcgr3a基因的外显子6的部分包含外显子6的5’端至少5bp连续核苷酸序列和/或3’端至少5bp连续核苷酸序列。在一些实施例中，所述编码人或人源化fcgr3a的序列进一步包含人fcgr3a的5’utr和/或3’utr。在一些实施例中，所述人fcgr3a基因的部分还包含人fcgr3a基因的5’utr上游至少50bp连续核苷酸序列和/或3’utr下游至少50bp连续核苷酸序列。在一些实施例中，所述编码人或人源化fcgr3a的核苷酸序列包含人5’utr上游至少4262bp，优选的，所述核苷酸序列还包含人3’utr下游至少5724bp连续核苷酸。在一些实施例中，所述人fcgr3a基因的部分包含人fcgr3a基因的5’utr上游至少50bp连续核苷酸序列至外显子6的5’端至少5bp连续核苷酸序列、外显子6的3’端至少5bp连续核苷酸序列至人fcgr3a基因的3’utr下游至少50bp连续核苷酸序列。在一些实施例中，所述人fcgr3a基因的部分包含人fcgr3a基因的内含子1、内含子2和/或内含子3。在一些实施例中，所述人fcgr3a基因的部分的核苷酸序列包含或不包含突变，所述的突变例如第661位的t突变为g，导致编码的蛋白的氨基酸序列中，f突变为v。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含编码人fcgr3a胞外区和/或跨膜区的核苷酸序列。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含编码非人动物fcgr4胞质区的核苷酸序列。在一些实施例中，所述的人源化fcgr3a的核苷酸序列还包含非人动物内源fcgr4基因的部分。在一些实施例中，所述非人动物内源fcgr4基因的部分可以为基因组dna序列、cds或cdna序列。在一些实施例中，所述的非人动物内源fcgr4基因的部分包含非人动物内源fcgr4基因的外显子5的部分。在一些实施例中，非人动物内源fcgr4基因外显子5的部分包含至少5bp连续核苷酸序列。在一些实施例中，非人动物内源fcgr4基因外显子5的部分至少包括非人动物编码胞质区的核苷酸序列。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列从5’-3’包含：a)第一序列：编码人fcgr3a胞外区和跨膜区的全部或部分的核苷酸序列(优选还包含编码信号肽的核苷酸序列)；和b)第二序列：编码非人动物内源fcgr4胞质区的全部或部分的核苷酸序列。在一些实施例中，所述第一序列编码的氨基酸序列与seq id no：2第1-229位或seq id no：35第1-229位氨基酸序列一致或同一性至少为70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％或99.5％，所述第二序列编码的氨基酸序列与seq id no：1第225-249位氨基酸序列一致或同一性至少为70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％或99.5％。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含seq id no：5或seq id no：5第6786位由g突变为t，或包含与seqid no：5或seq id no.5第6786位由g突变为t所示核苷酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些实施例中，所述非人动物的基因组中修饰的fcgr3a基因转录的mrna包含seq id no：6或seq id no：34，或包含与seq id no：6或seq idno：34所示核苷酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些实施例中，人或人源化fcgr3a的核苷酸序列的表达通过调控元件调控，所述的调控元件优选为人fcgr3a的调控元件和/或非人动物fcgr4的调控元件(如，启动子、5'utr和/或3'utr)。在一些实施例中，非人动物内源fcgr4蛋白不表达或与野生型动物中fcgr4相比表达水平降低。在一些实施例中，所述非人动物基因组中修饰的fcgr3a基因对于内源被替换的基因座为纯合或杂合。

4、在一方面，本发明提供了一种非人动物或其构建方法，所述非人动物包含至少一个编码人或人源化fcgr3a蛋白的核苷酸序列的细胞，其中所述人源化fcgr3a蛋白包含与人fcgr3a蛋白至少50、100、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、240、250、251、252、253或254个连续氨基酸序列一致。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a蛋白包含至少50、100、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228或229个连续氨基酸与人fcgr3a信号肽、胞外区和跨膜区的连续氨基酸序列一致。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a蛋白与seq id no：2第1-229位或seq id no：35第1-229位氨基酸序列一致或同一性至少为70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％或99.5％。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a蛋白包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、21、22、23、24或25个连续氨基酸与非人动物内源胞质区的连续氨基酸序列一致。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a蛋白与seqid no：1第225-249位氨基酸序列一致或同一性至少为70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％或99.5％。在一些实施例中，人或人源化fcgr3a的核苷酸序列可操作地连接至人或内源调控元件。在一些实施例中，所述人或人源化fcgr3a的核苷酸序列可被整合至所述非人动物内源fcgr4基因座。在一些实施例中，所述人或人源化fcgr3a蛋白具有至少一种活性，例如非人动物fcgr4活性和/或人fcgr3a活性。

5、在一方面，本发明提供了一种基因修饰的非人动物的构建方法，所述非人动物的至少一个细胞中，在非人动物内源fcgr4基因座处，用包含人或人源化fcgr3a的核苷酸序列替换非人动物内源fcgr4基因。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含人fcgr3a基因的部分。在一些实施例中，所述的人fcgr3a基因的部分包含人fcgr3a基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5的全部和/或外显子6的部分，优选的，人fcgr3a基因的外显子6的部分包含外显子6至少5-1441bp，例如5、10、50、100、110、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1253、1300、1350、1360、1361、1362、1363、1364、1365、1400、1440或1441bp连续核苷酸。进一步优选的，人fcgr3a基因的外显子6的部分包含外显子6的5’端至少5-110bp，例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、105或110bp连续核苷酸序列，和/或，包含外显子6的3’端至少5-1253bp，例如5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200或1253bp连续核苷酸序列。在一些实施例中，所述人fcgr3a基因的部分包含人fcgr3a基因的5’utr上游至少50-10000bp，例如50、100、500、1000、2000、3000、4000、4262、5000、6000、7000、8000、9000或10000bp连续核苷酸序列(优选包含人fcgr3a基因的5’utr上游至少4000-5000bp连续核苷酸序列)，和/或，人fcgr3a基因的3'utr下游至少50-10000bp例如50、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、5724、6000、7000、8000、9000或10000bp连续核苷酸序列(优选包含人fcgr3a基因的3’utr下游至少5000-6000bp连续核苷酸序列)。在一些实施例中，所述人fcgr3a基因的部分包含人fcgr3a基因的内含子1、内含子2和/或内含子3。在一些实施例中，所述的人源化fcgr3a的核苷酸序列还包含非人动物内源fcgr4基因的部分。在一些实施例中，所述的非人动物内源fcgr4基因的部分包含非人动物内源fcgr4基因外显子5的部分；优选的，非人动物内源fcgr4基因外显子5的部分包含至少5-625bp，例如5、10、50、70、75、76、77、78、79、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、610、620或625bp连续核苷酸序列，优选的，非人动物内源fcgr4基因外显子5的部分包含编码非人动物内源fcgr4胞质区的核苷酸序列。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列编码的氨基酸序列包含seq idno：7或seq id no：33，或包含与seq id no：7或seq id no：33所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些实施例中，非人动物内源fcgr4基因的外显子1-5的全部或部分被替换。在一些实施例中，被替换的非人动物内源fcgr4基因还包含非人动物内源fcgr4基因的5’utr上游至少50-10000bp，例如50、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、6500、6700、6764、7000、8000、9000或10000bp连续核苷酸，和/或，包含非人动物内源fcgr4基因的3’utr下游至少50-1000bp，例如50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、800、872、900、950或1000bp连续核苷酸。在一些实施例中，所述非人动物的内源fcgr4蛋白不表达或与野生型动物中fcgr4相比表达水平降低。在一些实施例中，所述人或人源化fcgr3a的核苷酸序列可操作地连接至人或非人动物内源调控元件，所述的调控元件如，启动子、5’utr和/或3’utr。在一些实施例中，所述非人动物为哺乳动物，如，猴子或啮齿动物。在一些实施例中，所述的啮齿动物包括小鼠或大鼠。在一些实施例中，所述非人动物还包括其他基因编码的人或人源化蛋白的核苷酸序列，所述人或人源化蛋白包括nkp46、cd3e、egfr、ccr8、nkg2d、cd32、cd64、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一种。

6、在一方面，本发明提供了一种表达人或人源化fcgr3a的基因修饰非人动物细胞的构建方法，所述构建方法包括在非人动物内源fcgr4基因座处，编码非人动物内源fcgr4区域的核苷酸序列被人或嵌合fcgr3a的核苷酸序列(如，人源化fcgr3a的核苷酸序列)替换，产生基因修饰的非人动物细胞，所述基因修饰的非人动物细胞表达人或人源化fcgr3a蛋白。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含人fcgr3a基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5的全部和/或外显子6的部分，以及非人动物内源fcgr4基因的外显子5的部分。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含人fcgr3a基因的内含子1、内含子2和/或内含子3。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含或不包含内含子4和内含子5。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含人fcgr3a基因5’utr上游至少50bp连续核苷酸，和/或，3’utr下游至少50bp连续核苷酸。在一些实施例中，人源化fcgr3a的核苷酸序列编码的氨基酸序列与seq id no：7或seq id no：33所示氨基酸序列一致或同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列与seq id no：5或seq m no：5第6786位由g突变为t所示核苷酸序列一致或同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些实施例中，被替换的编码非人动物内源fcgr4区域的核苷酸序列包含非人动物内源fcgr4基因外显子1-5的全部。在一些实施例中，被替换的编码非人动物内源fcgr4基因还包含非人动物内源5’utr上游至少50bp连续核苷酸，和/或，非人动物内源3’utr下游至少50bp连续核苷酸。在一些实施例中，所述人或人源化fcgr3a的核苷酸序列可操作地连接至人或非人动物内源的调控元件，所述的调控元件如，启动子、5’utr和/或3’utr。在一些实施例中，所述非人动物是小鼠。

7、在一方面，本发明提供了一种测定治疗剂治疗疾病有效性的方法，所述方法包括：1)向上述非人动物或上述构建方法获得的非人动物施用治疗剂，其中所述非人动物患有疾病；2)确定治疗剂对疾病的抑制作用。在一些实施例中，所述治疗剂包括抗fcgr3a抗体、寡核苷酸药物或多肽药物中的一种或两种以上。在一些实施例中，所述的治疗剂还包括附加治疗剂，所述的附加治疗剂例如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体或抗ctla4抗体中的一种或两种以上。在一些实施例中，所述疾病包括肿瘤、炎症或免疫疾病。在一些实施例中，所述的肿瘤包括实体瘤、消化道癌、黑色素瘤、胃癌、子宫内膜癌、肠癌、淋巴瘤、乳腺癌、内分泌癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌或卵巢癌中的一种或两种以上。在一些实施例中，所述的免疫疾病包括艾滋病、骨质疏松、重症肌无力、移植物抗宿主病(gvhd)、银屑病、过敏、哮喘、特异性皮炎、心肌炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫肝病、疼痛或神经系统疾病中的一种或两种以上。在一些实施例中，所述的炎症包括退行性炎症、渗出性炎症(例如浆液性炎症、纤维蛋白炎症、化脓性炎症、出血性炎症、坏死性炎症、卡他性炎症)、增殖性炎症、特异性炎症(如肺结核、梅毒、麻风病或淋巴肉芽肿)或炎性肠病中的一种或两种以上。在一些实施例中，所述肿瘤包含一个或多个肿瘤细胞注射到非人动物体内。在一些实施例中，通过测量非人动物的肿瘤体积，判定治疗剂对肿瘤的抑制作用。

8、在一方面，本发明提供了一种测定fcgr3a治疗剂毒性的方法，所述方法包括：1)向上述非人动物或上述构建方法获得的非人动物施用fcgr3a治疗剂；2)测定fcgr3a治疗剂对非人动物的作用。在一些实施例中，所述测定fcgr3a治疗剂对非人动物的作用包括测量非人动物的体重或血液检查。在一些实施例中，所述的血液检查包括红细胞计数、血细胞比容或血红蛋白含量中的一种或两种以上。

9、在一方面，本发明提供了一种人源化fcgr3a蛋白，所述人源化fcgr3a蛋白包含人fcgr3a蛋白的部分和非人动物内源fcgr4蛋白的部分。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a蛋白包含人fcgr3a蛋白的跨膜区、人fcgr3a蛋白的胞外区以及非人动物内源fcgr4蛋白的胞质区。在一些实施例中，所述的人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列包含seq id no.2或seqid no：2第1-229位或seq id no：35或seq id no：35第1-229位；或包含与seq id no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no.35或seq id no：35第1-229位同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些实施例中，所述的人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列包含seq id no：1或seq id no：1第225-249位；或包含与seq id no：1或seq idno：1第225-249位氨基酸同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a蛋白包含seq id no：7或seq id no：33，或包含与seqid no：7或seq id no.33所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。

10、在一方面，本发明提供了一种人源化fcgr3a基因，所述人源化fcgr3a基因编码上述人源化fcgr3a蛋白。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a基因包含人fcgr3a基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5的全部和/或外显子6的部分，优选的，所述人源化fcgr3a基因包含人fcgr3a基因的内含子1、内含子2和/或内含子3。所述人源化fcgr3a基因还包含非人动物内源fcgr4基因外显子5的部分。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a基因包含的核苷酸序列包含seq id no：3、4、5、6、8、9、27、28、29、30或34所示核苷酸序列，或包含与seq id no：3、4、5、6、8、9、27、28、29、30或34所示核苷酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。

11、在一方面，本发明提供了一种细胞、组织或器官，所述细胞、组织或器官表达所述的人源化fcgr3a蛋白，和/或，所述细胞、组织或器官中包含所述的人源化fcgr3a基因。

12、在一方面，本发明提供了一种动物模型，所述的动物模型表达所述的人源化fcgr3a蛋白，和/或，所述的动物模型包含所述的人源化fcgr3a基因。

13、在一方面，本发明提供了一种所述非人动物、所述构建方法获得的非人动物、所述的人源化fcgr3a蛋白、所述的人源化fcgr3a基因、所述的细胞、组织或器官或所述动物模型的应用。在一些实施例中，所述应用包含：a)涉及人类细胞的与fcgr3a相关的免疫过程的产品开发中的应用；b)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与fcgr3a相关的模型系统中的应用；c)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与fcgr3a相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；d)在体内研究人fcgr3a信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，e)研究fcgr3a基因功能，研究针对人fcgr3a靶位点的药物、药效，研究与fcgr3a相关疾病治疗药物方面的应用。

14、除非另有定义，本技术使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本技术描述了用于本发明的方法和材料；可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅是示例性的而非限制性的。本技术提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均通过引用整体并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

15、本发明术语“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的部分个体。

16、本发明术语“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段dna片段，既可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如“非人动物内源fcgr4基因座”可以是fcgr4基因的任选一段的dna片段。

17、本发明术语“外显子xx的部分”表示连续或间隔几个、几十个、几百个或几千个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致，例如人fcgr3a基因的外显子6的部分，包括连续或间隔的5-1441bp，例如5、10、50、100、110、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1253、1300、1350、1360、1361、1362、1363、1364、1365、1400、1440或1441bp连续核苷酸。在一些实施例中，人fcgr3a基因的外显子6的部分，包括间隔的几段核苷酸序列，例如人fcgr3a基因的外显子6的部分包含外显子6的5’端至少5-110bp，例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、105或110bp连续核苷酸序列，和/或，包含外显子6的3’端至少5-1253bp，例如5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1 100、1200或1253bp连续核苷酸序列。

18、本发明术语“外显子xx-xxx”或“外显子xx至xxx”或“外显子xx至外显子xxx”是指包含一个外显子至另一个外显子以及期间的内含子的全部核苷酸序列，例如外显子1-5的全部包含外显子1、内含子1、外显子2、内含子2、外显子3、内含子3、外显子4、内含子4和外显子5的全部核苷酸序列。

19、本发明术语“内含子xx”是指两个外显子之间的内含子，例如内含子1是指外显子1和外显子2之间的内含子。

20、本发明术语“包含”或“包括”为开放式写法，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。当用于描述蛋白质或核苷酸的序列时，所述蛋白质或核苷酸可以是由所述序列组成，或在所述蛋白质或核苷酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有与原序列相同或相似的活性。

21、本发明术语“和/或”包含该术语连接的项目的所有组合，应视为各个组合已单独地在本技术列出。例如“a和/或b”包括“a”、“b”以及“a和b”，再如“a、b和/或c”包括“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。

22、本发明术语“严格条件”是指形成特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件，包括高、中或低严格条件，所述的严格条件是本领域技术人员公知的，例如可以参见molecularcloning(thirdedition,cold spring harbor laboratory press,new york)、current protocols in molecularbiology(edited by frederick m.ausubel et al.,1987)and short protocols in molecular biology，edausubel,et a1.通过引用并入本技术，严格条件取决于序列。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。

23、本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。

24、详细说明

25、fcgr3a

26、在人的基因组中，fcgr3a基因(ncbi gene id：2214)包含6个外显子，即外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5和外显子6(图1)。人fcgr3a mrna的核苷酸序列为nm_001127595.2，人fcgr3a的氨基酸序列为np_001121067.1(seq id no：2)。基于转录本nm_001127595.2及其编码蛋白np_001121067.1的核苷酸序列和氨基酸序列中每个外显子对应位置如表1所示：

27、表1

28、

29、在小鼠的基因组中，fcgr4基因(ncbi gene id：246256)包含5个外显子，即外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5(图1)。小鼠fcgr4mrna的核苷酸序列为nm_144559.2，小鼠fcgr4的氨基酸序列为np_653142.2(seq id no：1)。基于转录本nm_144559.2及其编码蛋白np_653142.2的核苷酸序列和氨基酸序列中每个外显子对应位置如表2所示：

30、表2

31、

32、

33、本领域中其他物种的fcgr3a基因、蛋白和基因位点也是已知的。例如，rattusnorvegicus(大鼠)、macaca mulatta(恒河猴)、canis lupus familiaris(狗)，sus scrofa(猪)。这些基因的相关信息(如，内含子序列、外显子序列和氨基酸序列)均可以在ncbi中查找到，其全部内容通过引用并入本技术。

34、本发明提供一种人或嵌合(如，人源化)fcgr3a核苷酸序列或人或嵌合(如，人源化)fcgr3a氨基酸序列。在一些实施例中，非人动物内源fcgr4基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5的全部或部分核苷酸序列，和/或，编码非人动物内源fcgr4蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列被人或人源化fcgr3a基因的核苷酸序列替换。所述“部分”是指至少50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、650、700、800、900、1000、1200、1250、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、10836、11000、11708、12000、15000、17600、18000或18472bp连续核苷酸序列，或者至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、210、220、221、222、223、224、225、230、240、245或249个连续氨基酸序列。在一些实施例中，所述“部分”与非人动物内源fcgr4基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5，或者，编码非人动物内源fcgr4蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列一致或同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99.5％。在一些实施例中，非人动物内源fcgr4基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5的“部分”或“全部”序列(例如，非人动物内源fcgr4基因5'utr上游核苷酸序列至3'utr下游核苷酸序列)被人或人源化fcgr3a基因序列替换(例如，人fcgr3a基因的5'utr上游核苷酸序列至外显子6的5’端、非人动物内源fcgr4基因外显子5的部分、人fcgr3a基因的外显子6的3’端)至3’utr下游核苷酸序列)。

35、在一些实施例中，本发明提供了一种基因修饰的非人动物，基因修饰的非人动物的基因组包括人或嵌合(如，人源化)fcgr3a核苷酸序列。在一些实施例中，所述嵌合fcgr3a核苷酸序列编码的蛋白包含人或人源化的信号肽，人或人源化的胞外区，人或人源化的跨膜区，非人动物内源的胞质区。在一些实施例中，嵌合fcgr3a核苷酸序列编码的蛋白与seqid no：1、2或7的全部或部分所示氨基酸序列一致或同一性至少为70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，基因修饰的非人动物基因组包含的核苷酸序列与seq idno：3、4、5、6、8、9、10、11、27、28、29、30或34所示核苷酸序列一致或同一性至少为70％、80％、85％、90％、95％或99.5％。

36、在一些实施例中，基因修饰的非人动物包含编码人或人源化fcgr3a蛋白的序列。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白从n端-c端包含，信号肽，胞外区，跨膜区和胞质区。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白包含人或人源化的信号肽，例如，人或人源化的信号肽包含的序列与seq id no：2第1-16位氨基酸一致或同一性至少为70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白包含非人动物内源的信号肽，例如，非人动物内源的信号肽包含的序列与seq id no：1第1-20位氨基酸一致或同一性至少为70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白包含人或人源化的胞外区，例如，人或人源化的胞外区包含的序列与seq id no：2第17-208位或seq id no：35第17-208位氨基酸一致或同一性至少为70％、80％、85％、90％、95％或99.5％。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白包含非人动物内源的胞外区，例如，非人动物内源的胞外区包含的序列与seq id no：1第21-203位氨基酸一致或同一性至少为70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白包含人或人源化的跨膜区，例如，人或人源化的跨膜区包含的序列与seq id no：2第209-229位氨基酸一致或同一性至少为70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白包含非人动物内源的跨膜区，例如，非人动物内源的跨膜区包含的序列与seq id no：1第204-224位氨基酸一致或同一性至少为70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白包含人或人源化的胞质区，例如，人或人源化的胞质区包含的序列与seq id no：2第230-254位氨基酸一致或同一性至少为70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白包含非人动物内源的胞质区。例如，非人动物内源的胞质区包含的序列与seq id no：1第225-249位氨基酸一致同一性至少为70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白包含人fcgr3a蛋白的信号肽、人fcgr3a蛋白的胞外区、人fcgr3a蛋白的跨膜区以及非人动物内源fcgr4蛋白的胞质区，例如人源化fcgr3a蛋白包含seq id no：2第1-229位或seq id no：35第1-229位，以及seq id no：1第225-249位氨基酸序列。

37、在一些实施例中，编码非人动物内源fcgr4蛋白(seq id no：1)信号肽、胞外区、跨膜区和胞质区全部或部分的核苷酸序列被替换或失活。在一些实施例中，被编码人或人源化fcgr3a的核苷酸序列(seq id no：5或seq id no：5第6786位由g突变为t)替换。在一些实施例中，编码seq id no：1或seq id no：1第1-224位氨基酸的核苷酸序列被替换。

38、在一些实施例中，基因修饰的非人动物包含人或人源化fcgr3a基因。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a基因从5’-3’依次包含：人fcgr3a基因的外显子1，人fcgr3a基因的外显子2，人fcgr3a基因的外显子3，人源化的外显子4，优选的，人源化的外显子4为人和非人动物嵌合序列，包含人fcgr3a基因和非人动物内源fcgr4的嵌合cds序列的部分。优选包含人fcgr3a基因的外显子4的全部、人fcgr3a基因的外显子5的全部、人fcgr3a基因的外显子6的部分和非人动物内源fcgr4基因外显子5的部分。在一些实施例中，人源化fcgr3a基因还包含人fcgr3a基因的5’utr上游核苷酸序列和/或3'utr下游核苷酸序列。

39、在一些实施例中，基因修饰的非人动物包含人或人源化fcgr3a基因。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a基因包含4个外显子。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a基因包含人或人源化5'utr。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a基因包含人或人源化3'utr。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a基因包含非人动物内源fcgr4基因的5’utr。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a基因包含非人动物内源fcgr4基因的3’utr。

40、在一些实施例中，基因修饰的非人动物可以表达人fcgr3a和/或嵌合(如，人源化)fcgr3a蛋白。进一步的，所述人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列与seq id no：7或seq idno：：33一致或同一性至少为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

41、在一些实施例中，基因修饰的非人动物在人和/或内源调控元件(所述的调控元件如启动子、5'utr和/或3'utr)下表达人fcgr3a和/或嵌合fcgr3a蛋白(如，人源化fcgr3a)。非人动物内源fcgr4基因座的替换提供了一种在相同类型细胞中表达人或嵌合fcgr3a蛋白(如，人源化fcgr3a)的非人动物。经基因修饰的非人动物并未出现本领域已知的在某些其它转基因非人动物中观察到的潜在疾病。在非人动物中表达的人fcgr3a或嵌合fcgr3a蛋白可以维持一种或多种功能，例如野生型非人动物内源fcgr4蛋白的功能和/或人fcgr3a蛋白的功能。在一些实施例中，基因修饰的非人动物不表达非人动物内源fcgr4蛋白。在一些实施例中，基因修饰的非人动物的内源fcgr4蛋白表达降低。所述“内源fcgr4蛋白”是指基因修饰前的非人动物(如，小鼠)的内源fcgr4核苷酸序列编码的fcgr4蛋白。

42、在一些实施例中，基因修饰的非人动物的基因组包含编码与人fcgr3a蛋白(seqid no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no：35或seq id no：35第1-229位)和/或非人动物内源fcgr4蛋白(seq id no：1或seq id no：1第225-249位)所示氨基酸序列一致或同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸的核苷酸序列。在一些实施例中，基因修饰的非人动物的基因组包含与seq id no：5或seq id no：5第6786位由g突变为t所示核苷酸序列一致或同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。

43、在一些实施例中，基因修饰的非人动物的一个或多个细胞表达人或嵌合fcgr3a蛋白(如，人源化fcgr3a蛋白)。在一些实施例中，人或人源化fcgr3a蛋白包含与seq id no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no：35或seq id no：35第1-229位所示的氨基酸序列至少50、100、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、240、250、251、252、253或254个连续的氨基酸序列一致。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白包含与seq idno：1或seq id no：1第225-249位所示的氨基酸序列至少20、25、50、100、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、240或249个连续的氨基酸序列一致。

44、在一些实施例中，基因修饰的非人动物的基因组中，人源化fcgr3a基因对于内源被修饰基因座是杂合的或者是纯合的。

45、在一些实施例中，所述人源化fcgr3a基因组包含人fcgr3a基因的5'utr。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a基因组包含内源的(如，小鼠)5'utr。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a基因组包含人fcgr3a基因的3'utr。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a基因组包含内源的(如，小鼠)3'utr。在适当的情况下，基于人和非人动物序列的相似性，可以合理地推测非人动物和人的基因受到相似的调控。如本发明所述，基因修饰的非人动物的基因组中的人源化fcgr3a，包含非人动物内源fcgr4基因座的替换，该替换保留人源调控元件，并包含人源化fcgr3a编码序列。基因修饰的杂合子非人动物或纯合子非人动物中的人源化fcgr3a的表达是完全正常的。

46、在一些实施例中，本发明提供了一种基因修饰的非人动物，基因修饰的非人动物基因组包含非人动物内源fcgr4基因的缺失，其中非人动物内源fcgr4基因的缺失包含外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5，或内源fcgr4基因座的部分。

47、在一些实施例中，所述非人动物内源fcgr4基因的缺失进一步包含一个或多个内含子或内含子的部分，所述内含子选自非人动物内源fcgr4基因内含子1、内含子2、内含子3和/或内含子4。

48、在一些实施例中，本发明提供一种人源化fcgr3a基因组dna序列，提供了一个表达人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列的构建体；或一种包含所述构建体的细胞；或一种包含所述细胞的组织或器官。

49、在一些实施例中，本发明提供了一种嵌合的(如，人源化)fcgr3a核苷酸序列和/或氨基酸序列。在一些实施例中，所述嵌合的fcgr3a核苷酸序列和/或氨基酸序列与非人动物内源fcgr4mrna(如，nm_144559.2)、非人动物内源fcgr4氨基酸序列(如，np_653142.2，seqid no：1)，或其部分(如，外显子5的部分)序列一致或同一性至少为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％。在一些实施例中，所述嵌合的fcgr3a核苷酸序列和/或氨基酸序列与人fcgr3amrna序列(如，nm_001127595.2)、人fcgr3a氨基酸序列(如，np_001121067.1，seq id no：2)，或其部分(如，5'utr上游核苷酸序列至外显子6的5’端，外显子6的3’端至3’utr下游核苷酸序列)序列一致或同一性至少为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％。

50、在一些实施例中，编码非人动物fcgr4(例如小鼠fcgr4，seq id no：1)第1-249位氨基酸的核苷酸序列被编码人fcgr3a(seq id no：2第1-229位或seq id no：35第1-229位)氨基酸以及编码非人动物fcgr4(seq id no：1第225-249位)氨基酸的嵌合序列的核苷酸序列替换。

51、在一些实施例中，上述任一所述的核苷酸序列与调控元件可操作地连接，所述的调控元件如，人fcgr3a启动子，非人动物内源fcgr4启动子，诱导型启动子或增强子。

52、在一些实施例中，所述嵌合的核苷酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸，例如，连续或非连续核苷酸序列)不同于非人动物内源fcgr4核苷酸序列的全部或部分(例如，小鼠fcgr4基因转录本nm_144559.2的外显子1的全部至外显子5的部分)。

53、在一些实施例中，所述嵌合的核苷酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸，例如，连续或非连续核苷酸序列)与非人动物内源fcgr4核苷酸序列的全部或部分相同(例如，小鼠fcgr4基因转录本nm_144559.2的外显子5的部分)。

54、在一些实施例中，所述嵌合的核苷酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸，例如，连续或非连续核苷酸序列)不同于人fcgr3a核苷酸序列的全部或部分(例如，人fcgr3a基因转录本nm_001127595.2的外显子6的部分)。

55、在一些实施例中，所述嵌合的核苷酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸，例如，连续或非连续核苷酸序列)与人fcgr3a核苷酸序列的全部或部分相同(例如，人fcgr3a基因转录本nm_001127595.2的5’utr上游核苷酸序列至外显子6的5’端，以及，外显子6的3’端至3’utr下游核苷酸序列)。

56、在一些实施例中，所述嵌合的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，如，连续或非连续氨基酸残基)不同于非人动物内源fcgr4蛋白氨基酸序列的全部或部分(例如，非人动物内源fcgr4蛋白序列np_653142.2(seq id no：1)第1-224位氨基酸)。

57、在一些实施例中，所述嵌合的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，例如，连续或非连续氨基酸残基)与非人动物内源fcgr4蛋白氨基酸序列的全部或部分相同(例如，非人动物内源fcgr4蛋白序列np_653142.2(seq id no：1)第225-249位氨基酸)。

58、在一些实施例中，所述嵌合的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，例如，连续或非连续氨基酸残基)不同于人fcgr3a蛋白氨基酸序列的全部或部分(例如，人fcgr3a蛋白序列np_001121067.1(seq id no：2)第230-254位氨基酸)。

59、在一些实施例中，所述嵌合的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，例如，连续或非连续氨基酸残基)与人fcgr3a蛋白氨基酸序列的全部或部分相同(例如，人fcgr3a蛋白序列np_001121067.1(seq id no：2)第1-229位氨基酸或seq id no：35第1-229位)。

60、本发明还提供一种人源化fcgr3a氨基酸序列，其中所述人源化fcgr3a氨基酸序列包含下列组中的任一种：

61、a)seq id no：1或seq id no：1第225-249位或seq id no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no：35或seq id no：35第1-229位或seq id no：7或seq id no：33所示氨基酸序列；

62、b)与seq id no：1或seq id no：1第225-249位或seq id no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no：35或seq id no：35第1-229位或seq id no：7或seq id no：33所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

63、c)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列能够在低严格条件或严格条件下与编码seq id no：1或seq id no：1第225-249位或seq id no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no：35或seq id no：35第1-229位或seq id no：7或seq id no：33所示氨基酸的核苷酸序列杂交；

64、d)与seq id no：1或seq id no：1第225-249位或seq id no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no：35或seq id no：35第1-229位或seq id no：7或seq id no：33所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

65、e)与seq id no：1或seq id no：1第225-249位或seq id no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no：35或seq id no：35第1-229位或seq id no：7或seq id no：33所示的，包括替换、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

66、本发明还提供一种人源化fcgr3a核苷酸(如，dna或rna)序列，其中所述人源化fcgr3a核苷酸序列包含下列组中的任一种：

67、a)如seq id no：3、4、5、6、8、9、10、11、27、28、29、30或34所示的核酸序列或编码人源化fcgr3a同源氨基酸序列的核酸序列；

68、b)能够在低严格条件或严格条件下与seq id no：3、4、5、6、8、9、10、11、27、28、29、30或34所示核苷酸序列杂交的核酸序列；

69、c)与seq id no：3、4、5、6、8、9、10、11、27、28、29、30或34所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或99.9％的核酸序列；

70、d)其编码的氨基酸序列与seq id no：1或seq id no：1第225-249位或seq id no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no：35或seq id no.35第1-229位或seq id no：7或seq id no：33所示氨基酸序列一致或同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；

71、e)编码的氨基酸序列与seq id no：1或seq id no：1第225-249位或seq id no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no：35或seq id no.35第1-229位或seq id no：7或seqid no：33所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

72、f)编码的氨基酸序列与seq id no：1或seq id no：1第225-249位或seq id no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no：35或seq id no.35第1-229位或seq id no：7或seqid no：33所示的，包括替换、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

73、本发明进一步提供了一种人源化的fcgr3a基因组dna序列。该dna序列由其转录得到的mrna逆转录获得，与seq id no：5或seq id no：5第6786位由g突变为t或seq id no：6或seq id no：34所示序列同源的dna序列一致或互补。

74、为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，为了最佳比较的目的对序列进行比对(例如，为了最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入间隙，并且为了比较的目的可以忽略非同源序列)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数量的函数，考虑到间隙的数量和每个间隙的长度，这需要引入以实现两个序列的最佳比对。例如，序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的blossum 62评分矩阵来完成。

75、具有相似物理化学性质的保守残基的百分比(同源性百分比)，例如亮氨酸和异亮氨酸，也可用于测量序列相似性。本领域已经定义了具有类似物理化学性质的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)的氨基酸，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支链侧链(如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨质、组氨酸)。在许多情况下，同源性百分比高于同一性百分比。

76、本发明还提供了包含本技术所述核苷酸序列的细胞、组织和非人动物(例如，小鼠)，以及在非人动物内源fcgr4基因座表达人或嵌合(例如，人源化)fcgr3a的细胞、组织和非人动物(如，小鼠)。

77、基因修饰的非人动物

78、本发明所述“基因修饰的非人动物”是指该非人动物基因组中至少一条染色体具有外源dna的非人动物。在一些实施例中，至少一个或多个细胞，例如，基因修饰的非人动物中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％或50％的细胞具有外源dna。具有外源dna的细胞可以是各种细胞，例如，体细胞、免疫细胞(例如t细胞、b细胞、nk细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突状细胞)、生殖细胞、囊胚或肿瘤细胞。在一些实施例中，提供了一种基因修饰的非人动物，包含被修饰的内源fcgr4基因座，包含外源序列(如，人源序列)，例如，用一个或多个人序列或人/非人嵌合序列替换一个或多个非人序列，或插入一个或多个人序列或人/非人嵌合序列。非人动物通常能够通过种系传播将基因修饰传递给后代。

79、本发明所述“嵌合(x)基因”或“嵌合(x)核酸”是指基因或核酸，其中所述基因或核酸的两个或多个部分来自不同物种，或者该基因或核酸的至少一部分的核苷酸序列与野生型动物中的核苷酸不同。在一些实施例中，嵌合(x)基因或嵌合(x)核酸的至少一部分核苷酸序列具有两个或多个不同的物种来源，例如，编码不同蛋白的序列或编码两个或多个不同物种的相同(或同源)蛋白的序列。在一些实施例中，嵌合(x)基因或嵌合(x)核酸是指人源化(x)基因或人源化(x)核酸。

80、本发明所述“嵌合(x)蛋白”或“嵌合(x)多肽”是指蛋白或多肽，其中所述多肽或蛋白的两个或多个部分来自不同物种，或者该蛋白或多肽的至少一部分的氨基酸序列与野生型动物中的氨基酸序列不同。在一些实施例中，嵌合(x)蛋白或嵌合(x)多肽的至少一部分氨基酸序列具有两个或多个不同物种来源，例如，不同物种的相同(或同源)蛋白。在一些实施例中，嵌合(x)蛋白或嵌合(x)多肽是指人源化(x)蛋白或人源化(x)多肽。

81、本发明所述“人源化(x)蛋白”或“人源化(x)多肽”是指蛋白或多肽，其中所述蛋白或多肽的至少一部分来自人(x)蛋白或人(x)多肽。在一些实施例中，所述蛋白或多肽的至少一部分来自非人动物，在一些实施例中，人源化(x)蛋白或人源化(x)多肽是指人(x)蛋白或人(x)多肽。在一些实施例中，人源化(x)蛋白或人源化(x)多肽是指人/非人动物嵌合(x)蛋白或人/非人动物嵌合(x)多肽。

82、本发明所述“人源化(x)核酸”或“人源化(x)基因”是指核酸，其中所述核酸的至少一部分来自人。在一些实施例中，所述核酸中的至少一部分来自来源于非人动物。在一些实施例中，人源化(x)核酸或人源化(x)基因是指人源化外显子，所述人源化外显子可以是人的外显子或嵌合外显子。

83、在一些实施例中，嵌合(x)基因或嵌合(x)核酸是人源化fcgr3a基因或人源化fcgr3a核酸。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a基因或人源化fcgr3a核酸的至少一部分来源于人fcgr3a基因。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a基因或人源化fcgr3a核酸的至少一部分来源于非人动物内源fcgr4基因。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a基因或人源化fcgr3a核酸包含编码人源化fcgr3a蛋白的序列。编码的人源化fcgr3a蛋白至少具有一种人fcgr3a蛋白或非人动物内源fcgr4蛋白的活性。

84、在一些实施例中，所述嵌合(x)蛋白或嵌合(x)多肽是人源化fcgr3a蛋白或人源化fcgr3a多肽。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a蛋白或人源化fcgr3a多肽的氨基酸序列的至少一个或多个部分来自人fcgr3a蛋白。在一些实施例中，所述人源化fcgr3a蛋白或者人源化fcgr3a多肽的氨基酸序列的至少一个或多个部分来自非人动物内源fcgr4蛋白。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白或人源化fcgr3a多肽是功能性的，或至少具有一种人fcgr3a蛋白或非人动物内源fcgr4蛋白的活性。

85、在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白包括与人fcgr3a蛋白5-254个氨基酸(连续或非连续)一致的多肽序列。在一些实施例中，多肽序列的长度为5-229、10-229或10-254个，例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、229、230、240、250或254氨基酸。

86、在一些实施例中，人源化fcgr3a基因或人源化fcgr3a核酸包括与人fcgr3a基因20-2153bp、20-18965bp或20-14002bp(连续或非连续)，例如20、50、100、500、1000、2000、2153、3000、4000、5000、6000、7000、8000、8979、9000、10000、11000、12000、13000、13240、13241、13500、13924、14000、14002、15000、16000、17000、18000或18965bp一致的核苷酸序列。

87、在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白的胞外区是人或人源化fcgr3a的。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白的信号肽是人的或人源化fcgr3a的。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白的胞质区是人或人源化fcgr3a的。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白的跨膜区是人的或人源化fcgr3a的。在一些实施例中，人源化fcgr3a蛋白的胞质区是非人动物内源fcgr4的。

88、在一些实施例中，基因修饰的非人动物包括非人动物内源fcgr4基因位点(基因座)的修饰。在一些实施例中，所述的修饰包含编码至少一部分成熟fcgr3a蛋白的核苷酸序列(例如，与成熟的人fcgr3a蛋白氨基酸序列同一性至少为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)。虽然在本发明中提供了可包含所述基因修饰的细胞(例如，es细胞、体细胞)，但在许多实施例中，基因修饰的非人动物包括对非人动物内源fcgr4基因位点的修饰。

89、在一些实施例中，基因修饰的非人动物可以在非人动物内源fcgr4基因座表达人fcgr3a和/或嵌合(例如人源化)fcgr3a，其中所述非人动物内源fcgr4基因已被人或人源化fcgr3a的基因和/或编码人或人源化fcgr3a蛋白的核苷酸序列或与编码人fcgr3a序列至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％或99％同一性的核苷酸序列取代或插入。在一些实施例中，非人动物内源fcgr4基因座被编码人或人源化fcgr3a蛋白的核苷酸序列修饰。

90、在一些实施例中，经基因修饰的非人动物可以在人或非人动物内源调控元件(如，启动子、5'utr和/或3'utr)的控制下，表达人fcgr3a和/或嵌合fcgr3a(例如，人源化fcgr3a)。在非人动物内源fcgr4基因座处进行插入或替换提供了在合适的细胞中表达人fcgr3a或嵌合fcgr3a(例如人源化fcgr3a)并且以不导致在本领域已知的一些其它转基因非人动物中观察到的潜在病理的方式获得的非人动物。在非人动物中表达的人fcgr3a或嵌合fcgr3a(例如人源化fcgr3a)可以在非人动物中维持野生型fcgr4或人fcgr3a的一种或多种功能。此外，在一些实施例中，非人动物不表达内源性fcgr4。在一些实施例中，与野生型动物中的fcgr4表达水平相比，非人动物内源fcgr4表达水平降低。本发明所用术语“内源fcgr4”是指在任何基因修饰之前由非人动物(例如小鼠)的内源fcgr4核苷酸序列表达的fcgr4蛋白。

91、在一些实施例中，基因修饰的非人动物的基因组包括编码与seq id no：2或seqid no：2第1-229位或seq id no：35或seq id no：35第1-229位一致或同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些实施例中，基因修饰的非人动物的基因组包含与seq id no：5或seq id no.5第6786位由g突变为t或seq id no：6或seq id no：34一致或同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些实施例中，基因修饰的非人动物的基因组包含与nm_001127595.2第1-822位，或其第661位包含突变，优选第661位为t或g，和901-2153位一致或同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些实施例中，基因修饰的非人动物的基因组包含与nm_144559.2第727-804位一致或同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。

92、在一些实施例中，基因修饰的非人动物的基因组可以包括在非人动物内源fcgr4基因座用编码人或人源化fcgr3a的序列替换编码非人动物内源fcgr4区域的序列。在一些实施例中，被替换的序列是非人动物内源fcgr4基因座的任何序列，例如外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4，或其任何组合。在一些实施例中，被取代的序列在非人动物内源fcgr4基因的调控区内。在一些实施例中，被替换的序列是非人动物内源fcgr4基因的外显子1-5的全部。在一些实施例中，被替换的序列还包含非人动物内源fcgr4基因的5'utr上游6764bp和3'utr下游872bp。

93、在一些实施例中，基因修饰的非人动物可以具有一个或多个表达人或嵌合fcgr3a(例如人源化fcgr3a)的细胞，所述人源化fcgr3a从n末端到c末端具有信号肽、胞外区、跨膜区和胞质区。在一些实施例中，信号肽包含与人fcgr3a的信号肽(例如，seq id no：2第1-16位的氨基酸)同一性至少为50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的序列。在一些实施例中，人源化fcgr3a的信号肽具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或16个氨基酸(例如，连续或非连续)的序列与人fcgr3a蛋白的信号肽一致。在一些实施例中，胞外区包含与人fcgr3a的胞外区(例如seq id no：2第17-208位或seq id no：35第17-208位)同一性至少为50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的序列。在一些实施例中，人源化fcgr3a的胞外区具有至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、160、170、180、190、191或192个氨基酸(连续或非连续)的序列与人fcgr3a胞外区一致。在一些实施例中，跨膜区包含与人fcgr3a的跨膜区(例如，seq id no：2第209-229位氨基酸)同一性至少为50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的序列。在一些实施例中，人源化fcgr3a的跨膜区具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个氨基酸(连续或非连续)与人fcgr3a蛋白跨膜区一致。在一些实施例中，胞质区包含与非人动物内源fcgr4的胞质区(例如，seq id no：1第225-249位氨基酸)同一性至少为50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的序列。在一些实施例中，人源化fcgr3a的胞质区具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸(连续或非连续)与非人动物内源fcgr4(例如小鼠fcgr4)的胞质区相同。

94、在一些实施例中，所述的人源化fcgr3a的整个信号肽，整个胞外区和整个跨膜区都来源于人fcgr3a序列。

95、在一些实施例中，基因修饰的非人动物的基因组包括：人fcgr3a基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5的全部和/或外显子6的部分(优选还包含人fcgr3a基因的内含子1、内含子2和/或内含子3)；或编码seq id no：2第1-229位或seq id no：35第1-229位氨基酸的核苷酸序列，优选的，还包含人fcgr3a基因5’utr上游核苷酸序列和/或3’utr下游核苷酸序列。在一些实施例中，人fcgr3a基因的5’utr上游核苷酸序列包含至少50-10000bp，例如50、100、500、1000、2000、3000、4000、4262、5000、6000、7000、8000、9000或10000bp连续核苷酸序列(优选包含人fcgr3a基因的5’utr上游至少4000-5000bp连续核苷酸序列)。在一些实施例中，人fcgr3a基因的3’utr下游核苷酸序列包含至少50-10000bp例如50、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、5724、6000、7000、8000、9000或10000bp连续核苷酸序列(优选包含人fcgr3a基因的3’utr下游至少5000-6000bp连续核苷酸序列)。

96、在一些实施例中，基因修饰的非人动物的基因组包括非人动物内源fcgr4基因(例如小鼠fcgr4)的外显子5的部分。在一些实施例中，非人动物内源fcgr4基因外显子5的部分包括至少1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、75、78、80、90、100、150、200、300、400、500、600、620或625bp核苷酸。

97、在一些实施例中，在非人动物内源fcgr4基因座处具有编码嵌合人/非人fcgr3a多肽的核苷酸序列，所述非人动物的细胞表面上表达功能性的fcgr3a。在一些实施例中，嵌合人/非人fcgr3a多肽的人部分可以包含由人fcgr3a基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5的全部和外显子6的部分编码的氨基酸序列。在一些实施例中，嵌合人/非人fcgr3a多肽的人部分包含与seq id no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no：35或seqid no：35第1-229位一致或同一性至少为80％、85％、90％、95％或99％的序列。在一些实施例中，嵌合人/非人fcgr3a多肽的非人动物部分可以包含由非人动物内源fcgr4基因的外显子5的部分编码的氨基酸序列。在一些实施例中，嵌合人/非人fcgr3a多肽的非人动物部分包含与seq id no：1或seq id no：1第225-249位一致或同一性至少为80％、85％、90％、95％或99％的序列。在一些实施例中，基因修饰的非人动物的基因组中修饰的基因对于内源被替换的基因座为纯合或杂合。在一些实施例中，基因修饰的非人动物的基因组中修饰的fcgr3a基因对于内源被替换的基因座为纯合或杂合。

98、在一些实施例中，人源化fcgr3a基因包含人fcgr3a基因的5’utr。在一些实施例中，人源化fcgr3a基因包含非人动物(例如小鼠)内源fcgr4基因的5'utr。在一些实施例中，人源化fcgr3a基因包含非人动物(例如小鼠)内源fcgr4基因的3'utr。在一些实施例中，人源化fcgr3a基因座包含人fcgr3a基因的3'utr。在适当的情况下，可以合理地假设，基于非人动物和人基因序列的相似性，它们可能受到类似的调节。如本技术所示，在非人动物(例如小鼠)内源fcgr4基因座包含插入或替换的人源化fcgr3a，其保留非人动物内源或人调控元件，但包含编码序列的人源化，不表现出病理现象。人源化fcgr3a杂合或纯合的两种基因修饰非人动物都是正常的。

99、在一些实施例中，本发明还提供了一种基因修饰的非人动物，其基因组包含非人动物内源fcgr4基因的破坏，非人动物内源fcgr4的基因的破坏包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5缺失，或其部分缺失。

100、在一些实施例中，非人动物内源fcgr4基因的破坏还包括选自内含子1、内含子2、内含子3、内含子4中的一个或多个内含子的缺失。

101、在一些实施例中，非人动物内源fcgr4基因的破坏包括外显子1、内含子1、外显子2、内含子2、外显子3、内含子3、外显子4、内含子4和/或外显子5的至少50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、650、700、800、900、1000、12001250、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、10836、1 1000、1 1708、12000、15000、17600、18000或18472bp核苷酸的缺失。

102、基因修饰的非人动物可以是各种非人动物，例如，小鼠、大鼠、兔子、猪、牛(例如，牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如，狨猴、恒河猴)。对于不容易获得合适的可遗传修饰胚胎干细胞(es)的非人动物，采用其他方法来构建包含遗传修饰的非人动物。这样的方法包括，例如，修饰非es细胞基因组(例如，成纤维细胞或诱导多能干细胞)并采用核移植将修饰的基因组转移到合适的细胞，例如卵母细胞，以及在适当的条件下在非人动物中孕育修饰的细胞(例如，修饰的卵母细胞)以形成胚胎。上述所述构建方法在本领域中是已知的，并且在“a.nagy，et al.，“manipulating the mouse embryo：alaboratory manual(third edition)，”coldspring harbor laboratory press，2006”有所描述，其全部内容通过引用并入本技术。

103、在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一些实施例中，基因修饰的非人动物是啮齿动物。啮齿动物可以选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的非人动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

104、在一些实施例中，所述的非人动物可以是免疫缺陷的非人哺乳动物。例如免疫缺陷的啮齿动物、免疫缺陷的兔子、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的猴子等。

105、在一些实施例中，所述非人动物是c57bl品系的小鼠，所述c57bl品系选自c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl6、c57bl/10、c57bl10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola。在一些实施例中，小鼠是选自129/j、129/rej、129/olahsd、129/sv、129/svj、129/re、129/rrj、129/sv-ter/+的129品系。这些小鼠描述于例如festing et al.，revisednomenclature for strain 129mice，mammalian genome 10：836(1999)；auerbach eta1.，establishment and chimera analysis of129/svev-and c57bl/6-derived mouseembryonic stem cell lines(2000)，上述文献相关内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，遗传修饰的小鼠是129品系和c57bl/6品系的杂交。在一些实施例中，小鼠是129品系的杂交，或c57bl/6品系的杂交。在一些实施例中，小鼠是balb品系，例如balb/c品系。在一些实施例中，小鼠是balb品系和另一品系的杂交。在一些实施例中，小鼠来自杂交系(例如，50％balb/c-50％12954/sv；或50％c57bl/6-50％129)。在一些实施例中，非人动物是啮齿动物。在一些实施例中，非人动物是具有balb/c、balb/chean、balb/cj、balb/cr1、balb/cwt、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl(c57bl/10cr和c57bl/ola)、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st或cba/h品系的小鼠在一些实施例中，非人动物是大鼠。大鼠可以选自wistar大鼠、lea品系、sprague-dawley品系、fischer品系、f344、f6和dark agouti。在一些实施例中，大鼠品系是选自wistar、lea、sprague-dawley、fischer、f344、f6和darkagouti的两种或多种品系的杂交物种。

106、本发明进一步涉及人源化小鼠的fcgr3a基因组dna序列，通过mrna逆转录获得的dna序列与该dna序列一致或互补；或表达其氨基酸序列的构建体；或包含其构建体的细胞；或包括其细胞的组织或器官。

107、本发明进一步涉及通过上述构建方法产生的非人哺乳动物。在一些实施例中，其基因组包含人或人源化fcgr3a基因。

108、在一些实施例中，非人哺乳动物是啮齿动物。在一些实施例中，非人哺乳动物为小鼠。

109、在一些实施例中，非人哺乳动物表达由人源化fcgr3a基因编码的蛋白。

110、此外，本发明还提供了一种携带肿瘤的非人哺乳动物模型，所述非人哺乳动物模型是通过本技术所述方法获得的。在一些实施例中，非人哺乳动物是啮齿动物(如，小鼠)。

111、本发明还提供了一种来源于非人哺乳动物或其后代、或携带肿瘤的非人哺乳动物的细胞或细胞系，或原代细胞培养物，其来源于非人哺乳动物或其后代、或携带肿瘤的非人哺乳动物、来源于非人哺乳动物或其后代的组织、器官或其培养物。当其携带肿瘤时来源于非人哺乳动物或其后代的肿瘤组织或携带肿瘤的非人哺乳动物。

112、本发明提供了一种通过上述任一构建方法产生的非人哺乳动物。在一些实施例中，提供了非人哺乳动物、基因修饰的非人动物，所述基因修饰的非人动物的基因组包含人或人源化fcgr3a的dna。

113、在一些实施例中，非人哺乳动物包括本技术所述基因构建体(例如，如图2或图7所示的基因构建体)。在一些实施例中，提供了一种表达人或人源化fcgr3a蛋白的非人哺乳动物。在一些实施例中，提供了一种特异性表达人或人源化fcgr3a蛋白的细胞、组织或器官。

114、在一些实施例中，基因修饰的非人动物中人或人源化fcgr3a蛋白的表达是可控的。如通过添加特异性诱导物或阻遏物。在一些实施例中，所述特异性诱导物选自四环素系统(tet-offsystem/tet-on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。

115、非人哺乳动物可以是本领域已知的任何非人动物，其可用于本技术所述方法中。在一些实施例中，非人哺乳动物啮齿动物。在一些实施例中，非人哺乳动物是小鼠。

116、对上述描述的非人哺乳动物进行遗传、分子和行为分析。本发明提供了一种与相同基因型或其他基因型非人哺乳动物交配产生的后代。

117、本发明提供了一种来源于非人哺乳动物或其后代的细胞系或原代细胞培养物。例如可以通过以下方法制备基于细胞培养的动物模型。细胞培养物可以通过从非人哺乳动物中分离获得，或者可以使用相同构建体和用标准细胞转染技术建立的细胞培养物中获得细胞。包含编码人或人源化fcgr3a蛋白的dna序列的遗传结构的整合可以通过多种方法检测。

118、有许多分析方法可用于检测外源性dna，包括核酸水平的方法(包含使用逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr)或southern blot以及原位杂交)和蛋白水平的方法(包括组织化学分析，免疫印迹分析和体外结合研究))。此外，目的基因的表达水平可以通过本领域技术人员熟知的elsa方法进行量化。许多标准的分析方法可用于完成定量检测。例如，可以使用rt-pcr和杂交方法检测转录水平，包括rna酶保护分析法，southern blot，rna斑点杂交分析(rnadot)。免疫组织化学染色、流式细胞术、westernblot也可用于检测人或人源化fcgr3a蛋白的存在。

119、在一些实施例中，本技术所述的经遗传修饰的动物(例如，fcgr3a基因人源化纯合小鼠)可以在一个或多个细胞中表达人或人源化fcgr3a。

120、载体

121、本发明提供了一种靶向载体，包括：a)与待改变的转换区5’端同源的dna片段(5’同源臂或5’臂)，其选自fcgr4基因的基因组dna，长度为100至10000个核苷酸；b)供体序列；和c)与待改变的转换区3’端同源的dna片段(3’同源臂或3’臂)，其选自fcgr4基因的基因组dna，长度为100至10000个核苷酸。

122、在一些实施例中，a)与待改变的转换区5’端同源的dna片段选自与ncbi登录号为nc_000067.7至少具有90％同一性的核苷酸序列；c)与待改变的转换区3’端同源的dna片段选自与ncbi登录号为nc_000067.7至少具有90％同一性的核苷酸序列。

123、在一些实施例中，a)与待改变的转换区5’端同源的dna片段选自于ncbi登录号为nc_000067.7的第170835769至170839730位的核苷酸序列；c)与待改变的转换区3’端同源的dna片段选自于ncbi登录号为nc_000067.7的第170858203至170862315位的核苷酸序列。

124、在一些实施例中，a)与待改变的转换区5’端同源的dna片段选自于ncbi登录号为nc_000067.7的第170838843至170839730位的核苷酸序列；c)与待改变的转换区3’端同源的dna片段选自于ncbi登录号为nc_000067.7的第170858203至170860272位的核苷酸序列。

125、在一些实施例中，靶向载体所选的基因组核苷酸序列(基因组dna)长度可以超过约0.5kb、0.8kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、5.8kb、6kb、8kb、10kb、或15kb。

126、在一些实施例中，所述待改变的转换区位于非人动物内源fcgr4基因的外显子1至外显子5上。在一些实施例中，所述待改变的转换区位于非人动物内源fcgr4基因的5'utr上游核苷酸序列至3’utr下游核苷酸序列上。

127、在一些实施例中，所述靶向载体还包含一个或多个标记基因。例如，阳性克隆筛选的抗性基因或负筛选标记的编码基因。在一些实施例中，阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列neo。在一些实施例中，负筛选标记的编码基因为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。

128、在一些实施例中，所述5’臂为与ncbi登录号为nc_000067.7至少具有90％同一性的核苷酸，进一步优选的，所述5’臂序列包含seq id no：3和27所示核苷酸序列。在一些实施例中，所述3’臂为与ncbi登录号为nc_000067.7至少具有90％同一性的核苷酸，进一步优选的，所述3’臂序列包含seq id no：4和28所示核苷酸序列。

129、在一些实施例中，所述靶向载体包含供体序列，在一些实施例中，所述供体序列包括人或人源化fcgr3a的核苷酸序列。例如，靶向载体中的供体序列包括：人fcgr3a基因的部分或全部核苷酸序列，优选人fcgr3a基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5和/或外显子6，进一步优选的，还包含非人动物内源fcgr4基因的部分或全部核苷酸序列，优选非人动物内源fcgr4基因的外显子5。更优选的，还包含人fcgr3a基因的5'utr上游核苷酸序列和/或3'utr下游核苷酸序列。在一些实施例中，人或人源化fcgr3a的核苷酸序列编码人fcgr3a蛋白的全部或部分，例如ncbi的蛋白编号为np_001121067.1(seq id no：2)或其第1-229位或seq id no：35或seq id no：35第1-229位。在一些实施例中，人或人源化fcgr3a的核苷酸序列编码非人动物内源fcgr4蛋白的全部或部分，例如ncbi的蛋白编号为np_653142.2(seq id no：1)或其第225-249位。

130、在一些实施例中，所述的靶向载体从5’端到3’端依次包含5’臂、人fcgr3a基因5’utr上游核苷酸序列至外显子6的5’端、非人动物内源fcgr4基因外显子5的部分、外显子6的3’端至人fcgr3a基因3’utr下游核苷酸序列。

131、本发明还提供了用于构建人源化动物模型或敲除模型的载体。在一些实施例中，载体包含sgrna序列，其中sgrna序列靶向非人动物内源fcgr4基因，并且sgrna在待改变的转换区的靶序列(靶位点)上是唯一的，并且满足5'-nnn(20)-ngg3′或5'-ccn-n(20)-3′的序列排列规则。在一些实施例中，非人动物内源fcgr4基因中sgrna的靶位点位于非人动物内源fcgr4基因外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5上。在一些实施例中，非人动物内源fcgr4基因中sgrna的靶位点位于非人动物内源fcgr4基因5’utr上游核苷酸序列和/或3’utr下游核苷酸序列上。

132、在一些实施例中，靶向序列(靶位点)显示为seq id no：16和17。因此，本发明提供了用于构建基因修饰的动物模型的sgrna序列。在一些实施例中，寡核苷酸sgrna序列在seqid no：18和20中列出。在一些实施例中，寡核苷酸sgrna序列在seq id no：22和24中列出。在一些实施例中，寡核苷酸sgrna序列在seq id no：19和21中列出。在一些实施例中，寡核苷酸sgrna序列在seq id no：23和25中列出。

133、在一些实施例中，本公开涉及包括sgrna序列的质粒构建体(sgrna载体，例如pt7-sgrna)和/或包括该sgrna载体的细胞。

134、本发明还涉及包含所述的靶向载体或sgrna载体的细胞。

135、此外，本发明还提供了一种非人哺乳动物细胞，其具有上述靶向载体中的任何一种，以及本技术所述构建体(例如基因构建体或sgrna载体)的一种或多种体外转录物。在一些实施例中，细胞包含cas9 mrna或其体外转录物。

136、在一些实施例中，所述细胞中基因是杂合的。在一些实施例中，所述细胞中的基因是纯合的。

137、在一些实施例中，所述非人哺乳动物细胞是小鼠细胞。在一些实施例中，所述细胞是受精卵细胞。在一些实施例中，所述细胞是胚胎干细胞。在一些实施例中，所述细胞可以是任一表达fcgr3a蛋白的细胞。

138、基因修饰的非人动物的构建方法

139、基因修饰的非人动物可以通过本领域已知的几种基因编辑技术制备获得，包括利用胚胎干细胞的同源重组技术、基因打靶技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。在一些实施例中，优选使用同源重组技术。在一些实施例中，crispr/cas9基因编辑技术可以构建基因修饰的非人动物。在一些实施例中，crispr-cas9基因组编辑用于产生基因修饰的非人动物。这些基因组编辑技术中的许多技术是本领域已知的，并且在yin等人的“delivery technologiesfor genome editing,”nature reviews drug discovery 16.6(2017)：387-399,中进行了描述，该内容经引用并入本技术。本发明还提供了许多其他方法用于基因组编辑，例如，将转基因细胞显微注射到去核卵母细胞中，并将去核卵母细胞与另一个转基因细胞融合。

140、在一些实施例中，非人动物的至少一个细胞的内源基因组中编码内源fcgr4区域的核苷酸序列被编码人fcgr3a相应区域的核苷酸序列替换。在一些实施例中，编码fcgr4的胞外区、跨膜区和/或信号肽的核苷酸序列被编码人fcgr3a相应区域(即人胞外区、跨膜区和/或信号肽)的核苷酸序列替换。在一些实施例中，编码seq id no：1的第1-224位的核苷酸序列被编码人fcgr3a相应区域(优选seq id no：2的第1-229位或seq id no：35第1-229位)的核苷酸序列替换。在一些实施例中，编码seq id no：1的核苷酸序列被编码seq idno：2的核苷酸序列替换。在一些实施例中，所述非人动物内源fcgr4蛋白表达量与野生型动物相比降低或缺失。在一些实施例中，替换发生在生殖细胞、体细胞、囊胚或成纤维细胞等细胞中。体细胞或成纤维细胞的细胞核可以插入去核卵母细胞中。

141、图2或图7显示了小鼠fcgr4基因座的人源化打靶策略。靶向载体包含5’同源臂、人或人源化fcgr3a基因(dna和/或cdna)片段和3’同源臂组成的载体。该过程涉及利用同源重组将人或人源化fcgr3a序列替换非人动物内源fcgr4序列。在一些实施例中，靶位点上游和下游的切割(例如，通过锌指核酸酶、talen或crispr)可导致dna双链断裂，利用同源重组将人或人源化fcgr3a序列替换非人动物内源fcgr4序列。

142、在一些实施例中，所述的非人动物通过将下列任一种或两种以上核苷酸序列导入非人动物内源fcgr4基因座构建获得：

143、a)人fcgr3a基因的部分，优选包含人fcgr3a基因的外显子1至6的全部或部分，进一步优选包含人fcgr3a基因的外显子1至6中的一种、两种或三种以上的外显子，更进一步优选包含人fcgr3a基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5的全部和外显子6的部分(优选还包含人fcgr3a基因的内含子1、内含子2和/或内含子3)，优选还包含人fcgr3a基因的5’utr上游核苷酸序列和/或3’utr下游核苷酸序列；

144、b)编码人fcgr3a蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人fcgr3a蛋白的信号肽、胞外区、胞质区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人fcgr3a蛋白的信号肽、胞外区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，更优选的，包含编码人fcgr3a蛋白信号肽、胞外区和/或跨膜区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选包含编码seq id no：2第1-229位或seq id no：35第1-229位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与seq id no：2第1-229位或seq id no：35第1-229位所示氨基酸序列同一性至少为60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与seq id no：2第1-229位或seq idno：35第1-229位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与seq id no：2第1-229位或seq id no：35第1-229位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的核苷酸序列；

145、c)非人动物内源fcgr4基因的部分，优选包含非人动物内源fcgr4基因的外显子1至5的全部或部分，进一步优选包含非人动物内源fcgr4基因的外显子1至5中的一种、两种或三种以上的外显子，更进一步优选包含非人动物内源fcgr4基因的外显子5的部分；

146、d)编码非人动物内源fcgr4蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码非人动物内源fcgr4蛋白的信号肽、胞外区、胞质区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码非人动物内源fcgr4蛋白的胞质区的全部或部分核苷酸序列，更优选的，包含编码非人动物内源fcgr4蛋白胞质区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选包含编码seq id no：1第225-249位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与seq id no：1第225-249位所示氨基酸序列同一性至少为60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与seqid no：1第225-249位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与seq id no：1第225-249位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的核苷酸序列；

147、e)编码上述人源化fcgr3a蛋白的核苷酸序列；或，

148、f)上述的人源化fcgr3a基因。

149、优选的，所述的非人动物通过将seq id no：5或seq id no：5第6786位由g突变为t或编码seq id no.7或编码seq id no：33的核苷酸序列导入非人动物内源fcgr4基因座构建获得；或者，将包含与seq id no：5或seq id no：5第6786位由g突变为t所示核苷酸序列或编码seq id no.7或编码seq id no：33的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列导入非人动物内源fcgr4基因座构建获得；或者，将包含与seq id no：：5或seq id no：：5第6786位由g突变为t所示核苷酸序列或编码seq id no：7或编码seq id no：33的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物内源fcgr4基因座构建获得；或者，将包含具有seq id no：5或seq id no：5第6786位由g突变为t所示核苷酸序列或编码seq idno：7或编码seq id no：33的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物内源fcgr4基因座构建获得。

150、优选的，所述的非人动物使用上述的靶向载体和/或sgrna载体构建。

151、优选的，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，更优选的，所述其他基因包括nkp46、cd3e、egfr、ccr8、nkg2d、cd32、cd64、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一种。

152、优选的，所述的人或人源化fcgr3a基因和/或其他基因对于内源被修饰(优选替换或插入)基因座为纯合。

153、优选的，所述的人或人源化fcgr3a基因和/或其他基因对于内源被修饰(优选替换或插入)基因座为杂合。

154、优选的，所述的非人动物可以选自啮齿动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

155、优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿动物。更进一步优选的，所述的啮齿动物为大鼠或小鼠。

156、因此，本发明提供了一种fcgr3a基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化fcgr3a蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人fcgr3a基因的部分或人源化fcgr3a基因。

157、在一些实施例中，所述构建方法包括在非人动物内源fcgr4基因座(或位点)用编码人或人源化fcgr3a的核苷酸序列替换编码内源fcgr4区域的核酸序列。其中，所述人或人源化fcgr3a包含或不包含突变，优选的，该突变为f176v突变。在一些实施例中，所述构建方法可以包括在非人动物内源fcgr4基因座(或位点)插入编码人fcgr3a的核苷酸序列和编码非人动物内源fcgr4的核苷酸序列。插入的序列可以包括人fcgr3a基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5和/或外显子6的区域(例如，部分或全部区域)。在一些实施例中，插入的序列包括人fcgr3a基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5的全部和外显子6的部分(例如，nm_001127595.2的第1-822位，或其第661位包含突变，优选第661位为t或g，和901-2153位的核苷酸序列)。在一些实施例中，插入的序列包括非人动物内源fcgr4基因的外显子5的部分(例如nm_144559.2的第727-804位的核苷酸序列)。在一些实施例中，插入的序列包含编码人fcgr3a的信号肽(例如seq id no：2第1-16位氨基酸)、人fcgr3a的胞外区(例如seq id no.2第17-208位氨基酸或seq id no.35第17-208位)，人fcgr3a的跨膜区(例如seq id no：2的第209-229位氨基酸)和非人动物内源fcgr4胞质区(例如seq id no：1的第225-249位氨基酸)的核苷酸序列。在一些实施例中，非人动物内源fcgr4基因座(或位点)中小鼠内源fcgr4的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5被替换。在一些实施例中，被替换的序列包含小鼠内源fcgr4基因的5’utr上游6764bp至3'utr下游872bp的全部序列。

158、在一些实施例中，修饰非人动物的fcgr4基因座以表达嵌合人/非人动物fcgr3a多肽的方法可以包括用编码人或人源化fcgr3a的核苷酸序列替换非人动物内源fcgr4基因座处编码非人动物内源fcgr4的核苷酸序列，从而产生编码嵌合人/非人动物fcgr3a序列。在一些实施例中，所述方法可以包括在非人动物内源fcgr4基因座处插入编码嵌合人/非人动物fcgr3a的核苷酸序列，从而产生编码嵌合人/非人动物fcgr3a序列。

159、在一些实施例中，编码嵌合人/非人动物fcgr3a的核苷酸序列可以包括编码人fcgr3a信号肽、胞外区和跨膜区的全部或部分的第一核苷酸序列；和编码非人动物fcgr4的胞质区的全部或部分的第二核苷酸序列。

160、本发明还提供了一种建立fcgr3a基因人源化动物模型的方法，包括以下步骤：

161、(a)基于本技术所述的方法提供细胞(例如受精卵细胞)；

162、(b)培养所述细胞(优选在液体培养基中培养所述细胞)；

163、(c)将培养的细胞移植到受体雌性非人哺乳动物的输卵管或子宫，允许细胞在雌性非人哺乳类动物的子宫中发育；

164、(d)在步骤(c)中鉴定怀孕雌性的经基因修饰的人源化非人哺乳动物的后代中的种系传播。

165、在一些实施例中，上述方法中的非人哺乳动物是小鼠(例如c57bl/6小鼠)。

166、在一些实施例中，步骤(c)中的非人哺乳动物是具有假妊娠(或妊娠)的雌性。

167、在一些实施例中，用于上述方法的受精卵是c57bl/6受精卵。也可用于本技术所述方法的其他受精卵包括但不限于fvb/n受精卵、balb/c受精卵、dba/1受精卵和dba/2受精卵。

168、受精卵可以来自任何非人动物，例如本技术所述的任何非人动物。在一些实施例中，受精卵细胞来源于啮齿动物。基因构建体可以通过显微注射将dna导入受精卵。例如，通过在显微注射后培养受精卵，可以将培养的受精卵转移到假孕的非人动物身上，然后假孕的非人动物生下非人哺乳动物，从而产生上述方法中提到的非人哺乳动物。

169、在一些实施例中，制备经遗传修饰的非人动物的方法包括修饰非人动物的fcgr4基因的编码框架，例如，通过在人的fcgr3a基因调控元件控制下，用编码人或人源化fcgr3a相应区域的核苷酸序列替换编码内源fcgr4区域的核苷酸序列(例如，基因组dna、cds序列或cdna序列)。例如，非人动物的fcgr4基因的一个或多个功能区序列可以被敲除或插入序列，使得非人动物内源fcgr4蛋白不能表达或表达水平降低。在一些实施例中，修饰的非人动物的fcgr4基因的编码框可以是非人动物的fcgr4基因外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5的核苷酸序列的全部或部分。

170、在一些实施例中，用于制备遗传修饰的非人动物的方法包括：

171、(1)提供包含人或人源化fcgr3a基因片段的质粒，所述质粒侧翼为5’同源臂和3’同源臂，其中所述5’同源臂和3’同源臂靶向非人动物内源fcgr4；

172、(2)提供一种或多种靶向内源fcgr4基因的指导rna(sgrna)；

173、(3)通过使用步骤(1)的质粒、步骤(2)的sgrna和cas9来修饰受精卵或胚胎干细胞的基因组；

174、(4)将步骤(3)中获得的受精卵移植到假妊娠雌性小鼠的输卵管中，或者将步骤(3)中获得地胚胎干细胞移植到囊胚中，然后将囊胚移植到假孕雌性小鼠的输卵管中以产生功能性表达人源化fcgr3a蛋白的子代小鼠。

175、在一些实施例中，所述的方法还包括(5)将步骤(4)中获得的子代小鼠交配以获得纯合小鼠。

176、在一些实施例中，受精卵被crispr用靶向5’-末端靶位点和3’-末端靶位点的sgrna修饰。

177、在一些实施例中，编码人源化fcgr3a蛋白的序列与非人动物内源fcgr4基因座处的内源调控元件可操作地连接。

178、在一些实施例中，编码人源化fcgr3a蛋白的序列与人fcgr3a基因的调控元件可操作地连接。

179、在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物不表达内源fcgr4蛋白。

180、在一些实施例中，用于制备遗传修饰的非人动物的方法包括：

181、(1)提供包含人或人源化fcgr3a基因片段的质粒，所述质粒侧翼为5’同源臂和3’同源臂，其中所述5’同源臂和3’同种臂靶向内源fcgr4；

182、(2)提供一种或多种靶向非人动物内源fcgr4基因的指导rna(sgrna)；

183、(3)通过将所述人或人源化fcgr3a基因片段插入到非人动物内源fcgr4基因座中来修饰受精卵或胚胎干细胞的基因组。

184、在一些实施例中，所述的构建方法包括用人fcgr3a和非人动物内源fcgr4的嵌合序列替换非人动物内源fcgr4基因的5'utr上游核苷酸序列至3'utr下游核苷酸序列。

185、在一些实施例中，所述的构建方法包括用人源化fcgr3a基因或编码人源化fcgr3a蛋白的核苷酸序列替换非人动物基因组中编码非人动物内源fcgr4蛋白的核苷酸序列。

186、在一些实施例中，所述的构建方法包括用编码seq id no：7或seq id no：：33的核苷酸序列替换非人动物基因组中编码seq id no：1的核苷酸序列。

187、在一些实施例中，所述的构建方法包括用seq id no：5或seq id no：5第6786位由g突变为t替换非人动物基因组中编码seq id no：1的核苷酸序列。

188、基因修饰的非人动物的应用

189、在非人动物内源基因座并在人或内源调控元件(例如启动子、5'utr和/或3'utr)的控制下，用同源或直系源人类基因或人类序列替换非人动物基因或将同源或直系同源人类基因或人序列插入非人动物中，可以产生具有可能与典型的敲除加转基因动物显著不同的品质和特征的非人动物。在典型的敲除加转基因动物中，内源基因座被移除或破坏，全人转基因被插入动物的基因组中，并可能随机整合到基因组中。通常，整合转基因的位置是未知的；通过人基因和/或蛋白质测定和/或功能测定的转录来测量人类蛋白质的表达。在人转基因中，人序列的上游和/或下游为转基因的表达和/或调节提供合适的支持。

190、本发明证明在人源调控元件控制下，在内源基因座用人或人源化的序列替换或插入产生人源化动物，提供了生理上合适的表达模式和水平，其关于被替换基因的生理学在人源化非人动物的生理学的背景下是有意义的和合适的。

191、表达人或人源化fcgr3a蛋白的基因修饰非人动物或动物模型，例如，以生理学上合适的方式，提供了多种用途，包括但不限于开发人类疾病和病症的治疗方法，以及评估这些人类治疗方法在非人动物或动物模型中的毒性和/或功效。

192、本发明还提供了一种上述包含人源化fcgr3a基因修饰的非人动物、上述任一构建方法获得的非人动物的应用。

193、在一些实施例中，所述应用包含：

194、a)涉及人类细胞的与fcgr3a相关的免疫过程的产品开发中的应用；

195、b)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与fcgr3a相关的模型系统中的应用；

196、c)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与fcgr3a相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；

197、d)在体内研究人fcgr3a信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，

198、e)研究fcgr3a基因功能，研究针对人fcgr3a靶位点的药物、药效，研究与fcgr3a相关疾病治疗(例如肿瘤、炎症、免疫疾病)药物方面的应用。

199、本发明提供了一种表达人或人源化fcgr3a蛋白非人动物，该非人动物可用于人fcgr3a特异性调节剂的筛选。在一些实施例中，所述非人动物是人疾病动物模型。如，疾病是遗传诱导的(敲入或敲除)。在不同的实施例中，基因修饰的非人动物还包含受损的免疫系统，如，经过基因修饰的人源性组织异种移植，包括人实体瘤(例如，乳腺癌)或血细胞肿瘤(例如，淋巴细胞肿瘤、b或t细胞肿瘤)。

200、在一些实施例中，抗fcgr3a抗体阻断或抑制fcgr3a介导的信号通路。在一些实施例中，本技术所描述的抗fcgr3a抗体可以阻断fcgr3a复合物之间的相互作用，从而抑制fcgr3a信号通路。

201、在一些实施例中，基因修饰的非人动物可用于确定治疗剂(如，抗fcgr3a抗体)对治疗肿瘤的有效性。在一些实施例中，向非人动物施用治疗剂(如，抗fcgr3a抗体)，其中所述非人动物具有肿瘤，检测治疗剂对肿瘤的抑制作用。在一些实施例中，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。在一些实施例中，所述检测方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。在一些实施例中，所述检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

202、在一些实施例中，所述肿瘤细胞包括一个或多个被注射到动物体内的癌细胞(如，癌细胞来源于人或非人动物)。在一些实施例中，治疗剂抑制fcgr3a信号通路。在一些实施例中，治疗剂不抑制fcgr3a信号通路。

203、在一些实施例中，基因修饰的非人动物可用于检测抗fcgr3a抗体为激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，本技术描述的方法可以用来检测治疗剂(如，抗fcgr3a抗体)的功能，例如，所述治疗剂是否可以上调免疫应答或下调免疫应答，和/或该治疗剂是否能够诱导补体介导的细胞毒性(cmc)或抗体依赖性细胞毒性(adcc)。在一些实施例中，基因修饰的非人动物可用于确定治疗受试者疾病(例如肿瘤、炎症或免疫疾病)的治疗剂的有效剂量。对肿瘤的抑制作用也可以通过本领域已知的方法来确定，例如，测量非人动物中的肿瘤体积，和/或确定肿瘤(体积)抑制率(tgitv)。肿瘤生长抑制率可以使用公式tgitv(％)＝(1-tvt/tvc)x100计算，其中tvt和tvc是治疗组和对照组的平均肿瘤体积(或重量)。

204、在一些实施例中，治疗剂(如，抗fcgr3a抗体)可以被用于治疗各种肿瘤。本发明所述“肿瘤”是指具有自主生长能力的细胞，即以细胞生长迅速增殖为特征的异常状态或病症。该术语旨在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭性阶段如何。本发明所述“肿瘤”包括但不限于皮肤癌、淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述肿瘤为乳腺癌、胰腺癌、内分泌癌、头颈癌、胃肠癌、结直肠癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、神经内分泌瘤、间皮组织肿瘤、口咽肿瘤、女性生殖系统癌症或脑膜瘤。

205、在一些实施例中，治疗剂(例如，靶向fcgr3a的抗体；或靶向fcgr3a信号通路的药物)被设计用于治疗各种免疫疾病，包括类风湿性关节炎、克罗恩病、系统性红斑狼疮、或硬皮病。因此，本技术所述的方法可用于确定治疗剂(例如，靶向fcgr3a的抗体；或靶向fcgr3a信号通路的药物)在抑制免疫应答中的有效性。在一些实施例中，本技术所述的免疫疾病包括艾滋病、骨质疏松、重症肌无力、移植物抗宿主病(gvhd)、银屑病、过敏、哮喘、心肌炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫肝病、疼痛或神经系统疾病中的一种或两种以上。

206、在一些实施例中，治疗剂(例如，靶向fcgr3a的抗体；或靶向fcgr3a信号通路的药物)被设计用于治疗各种炎症，例如病毒性炎症。在一些实施例中，本技术所述的炎症包括急性炎症和慢性炎症。具体而言，炎症包括但不限于退行性炎症、渗出性炎症(例如浆液性炎症、纤维蛋白炎症、化脓性炎症、出血性炎症、坏死性炎症、卡他性炎症)、增殖性炎症、特异性炎症(如肺结核、梅毒、麻风病或淋巴肉芽肿)或炎性肠病中的一种或两种以上。在一些实施例中，本技术所述的炎症包括感染，并且感染是指由侵入人体的细菌、病毒、真菌、寄生虫和/或其他病原体引起的局部组织和全身炎症反应。

207、本发明还提供了一种确定治疗剂(如，抗fcgr3a抗体)毒性的检测方法。所述方法包括向上述所述非人动物施用治疗剂，评估非人动物的体重变化或血液检查，优选的，所述的血液检查包括红细胞计数、血细胞比容或血红蛋白中的一种或两种以上。在一些实施例中，抗体可使红细胞(rbc)、血细胞比容或血红蛋白降低20％、30％、40％或50％以上。在一些实施例中，非人动物的体重与对照组(如，未用抗体处理的非人动物的平均体重)相比至少小5％、10％、20％、30％或40％。

208、本发明还提供了一种通过本技术所述构建方法获得的非人动物或动物模型在开发与人类细胞免疫过程相关的产品、制造人抗体、或用于药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统。

209、在一些实施例中，提供了一种通过本技术所述的构建方法获得的非人动物或动物模型在生产和利用人体细胞的免疫过程的动物实验疾病模型、研究病原体、或制定新的诊断策略和/或治疗策略。

210、本发明还提供了通过本技术所述构建方法获得的非人动物或动物模型来筛选、验证、评估或研究fcgr3a基因功能、人fcgr3a抗体、靶向人fcgr3a的药物或有效性、例如治疗免疫疾病、肿瘤或炎症的药物。

211、在一些实施例中，本公开提供了一种验证tcr-t、car-t和/或其他免疫疗法(例如，t细胞过继转移疗法)的体内疗效的方法。例如，所述方法包括将人肿瘤细胞移植到本技术所述的非人动物中，并将人car-t应用于具有人肿瘤细胞的沟通动物。car-t治疗的有效性可以确定和评估。在一些实施例中，所述沟通动物选自通过本技术所述构建方法制备的fcgr3a基因人源化非人动物，通过本技术所描述的方法产生的双基因或多基因人源化非人动物(或其后代)，表达人或人源化fcgr3a蛋白的非人动物，或本技术所述的携带肿瘤或炎性动物模型。在一些实施例中，tcr-t、car-t和/或其他免疫疗法可以治疗fcgr3a相关疾病。在一些实施例中，tca-t、car-t和/或其他免疫疗法提供了用于治疗fcgr3a相关疾病的评估方法。

212、两个或多个人或人源化基因的非人动物模型

213、本发明还提供了一种具有两个或多个人或人源化基因的转基因动物模型或非人动物。该非人动物或动物模型可以包含人或人源化fcgr3a基因和编码额外的人或人源化蛋白的序列。

214、在一些实施例中，所述额外的人或人源化基因包含nkp46、cd3e、egfr、ccr8、nkg2d、cd32、cd64、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一种。在一些实施例中，所述非人动物或动物模型还表达人或人源化的nkp46、cd3e、egfr、ccr8、nkg2d、cd32、cd64、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4蛋白中的至少一种。

215、本发明还提供了一种两个或多个人或人源化基因的非人动物或动物模型的构建方法，所述构建方法包括：

216、(一)提供上述的构建方法获得非人动物或动物模型；

217、(二)将步骤(一)提供的非人动物或动物模型与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

218、在一些实施例中，所述其他基因修饰的非人动物包括基因nkp46、cd3e、egfr、ccr8、nkg2d、cd32、cd64、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的一种或两种以上的组合人源化的非人动物。

219、在一些实施例中，fcgr3a人源化直接在具有人或人源化nkp46、cd3e、egfr、ccr8、nkg2d、cd32、cd64、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中至少一种基因修饰的非人动物上进行。

220、由于这些蛋白可能涉及不同的机制，因此靶向其中两种或多种蛋白的联合疗法可能是一种更有效的治疗方法。事实上，许多相关的临床试验正在进行中，并显示出良好的效果。多基因修饰的非人动物模型可用于确定靶向两种或多种蛋白的联合治疗方法的有效性，例如，抗fcgr3a抗体，以及用于治疗肿瘤、炎症或免疫疾病(例如，哮喘或特异性皮炎)的附加治疗剂。所述联合治疗方法包括向非人动物施用抗fcgr3a抗体和附加治疗剂，其中非人动物患有疾病，并确定联合治疗方法对免疫肿瘤、炎症或免疫疾病的影响。在一些实施例中，所述附加治疗剂是特异性结合nkp46、cd3e、egfr、ccr8、nkg2d、cd32、cd64、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中至少一种的抗体。在一些实施例中，所述附加治疗剂是抗ctla4抗体(例如，ipilimumab)、抗pd-1抗体(例如，nivolumab)或抗pd-l1抗体。在一些实施例中，上述所述非人动物还包括编码人或人源化pd-1的序列、编码人或人源化pd-l1的序列、或编码人或人源化ctla-4的序列。在一些实施例中，附加治疗剂是抗pd-1抗体(例如，纳武利尤单抗、帕博利珠单抗)、抗pd-l1抗体或抗ctla-4抗体。在一些实施例中，上述所述肿瘤包括一个或多个表达pd-l1和/或pd-l2的肿瘤细胞。

221、在一些实施例中，该联合治疗方法用于治疗本技术所述的各种肿瘤，例如，实体瘤、消化道癌、黑色素瘤、胃癌、子宫内膜癌、肠癌、淋巴瘤、乳腺癌、内分泌癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌或卵巢癌中的一种或两种以上。在一些实施例中，联合治疗方法被设计用于治疗本技术所述的免疫紊乱，例如银屑病。

222、在一些实施例中，本技术所述的方法可用于评估与一些其他方法的联合治疗方法。可单独使用或与本技术所述方法结合使用的治疗癌症的联合治疗方法包括，例如，用化学疗法治疗受试者，例如，樟脑碱、多柔比星、顺铂、卡铂、丙卡巴嗪、甲氯雷他明、环磷酰胺、阿霉素、异环酰胺、马法兰、氯丁嘧啶、比硫芬、亚硝基脲、达克宁、柔红霉素、博莱霉素、普利霉素、丝裂霉素，依托泊苷、维拉帕米、鬼臼毒素、三苯氧胺、紫杉醇、转铂、5-氟脲酸、长春新碱、长春花素和/或甲氨蝶呤。或者，除此之外，所述联合治疗方法可以包括对受试者进行手术，以移除肿瘤的至少一部分，例如，从患者身上移除肿瘤的一部分或全部。

技术特征：

1.一种基因修饰的非人动物的构建方法，其特征在于，所述非人动物的基因组包含至少一条染色体，所述染色体包含编码人或人源化fcγ受体iiia(fcgr3a)蛋白的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述人源化fcgr3a蛋白包含人或人源化的胞外区、人或人源化的跨膜区和非人动物的胞质区。

3.根据权利要求1-2任一所述的构建方法，其特征在于，所述人或人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列包含seq id no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no：35或seq id no.35第1-229位；或包含与seq id no：2或seq id no：2第1-229位或seq id no：35或seq id no：35第1-229位同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。

4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，所述人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列包含seq id no：1或seq id no：1第225-249位；或包含与seq id no：1或seq id no：1第225-249位氨基酸同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。

5.根据权利要求1-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列包含seq id no：7或seq id no：33；或包含与seq id no：7或seq id no：33同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。

6.一种基因修饰的非人动物的构建方法，其特征在于，在非人动物内源fcgr4基因座处，用包含人或人源化fcgr3a的核苷酸序列替换非人动物内源fcgr4基因。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含人fcgr3a基因的部分；

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化fcgr3a的核苷酸序列还包含非人动物内源fcgr4基因的部分；

9.根据权利要求6-8任一所述的构建方法，其特征在于，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含seq id no：5或seq id no：5第6786位由g突变为t，或包含与seq id no：5或seq idno：5第6786位由g突变为t所示核苷酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。

10.根据权利要求6-9任一所述的构建方法，其特征在于，非人动物内源fcgr4基因的外显子1-5的全部被替换；

11.根据权利要求1-10所述的构建方法，其特征在于，所述编码人或人源化fcgr3a蛋白的核苷酸序列或人或人源化fcgr3a的核苷酸序列的表达通过调控元件调控，所述的调控元件优选为人fcgr3a的调控元件和/或非人动物fcgr4的调控元件；

12.根据权利要求1-11任一所述的构建方法，其特征在于，所述非人动物包括哺乳动物，如，猴子或啮齿动物，优选的，所述的啮齿动物包括小鼠或大鼠。

13.根据权利要求1-12任一所述的构建方法，其特征在于，所述非人动物的基因组中修饰的fcgr3a基因转录的mrna包含seq id no：6或seq id no：34，或包含与seq id no：6或seq id no：34所示核苷酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。

14.根据权利要求1-13任一所述的构建方法，其特征在于，所述非人动物还包括其他基因编码的人或人源化蛋白的核苷酸序列，所述人或人源化蛋白包括nkp46、cd3e、egfr、ccr8、nkg2d、cd32、cd64、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一种。

15.一种测定治疗剂治疗疾病有效性的方法，其特征在于，所述方法包括：

16.根据权利要求15所述的方法，所述疾病包括肿瘤、炎症或免疫疾病；

17.一种测定fcgr3a治疗剂毒性的方法，其特征在于，所述方法包括：

18.一种人源化fcgr3a蛋白，其特征在于，所述人源化fcgr3a蛋白包含人fcgr3a蛋白的跨膜区、人fcgr3a蛋白的胞外区以及非人动物内源fcgr4蛋白的胞质区；

19.一种人源化fcgr3a基因，其特征在于，所述人源化fcgr3a基因编码权利要求18所述人源化fcgr3a蛋白；

20.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述细胞、组织或器官表达权利要求18所述的人源化fcgr3a蛋白，和/或，所述细胞、组织或器官中包含权利要求19所述的人源化fcgr3a基因。

21.一种权利要求1-14任一所述构建方法获得的非人动物、权利要求18所述的人源化fcgr3a蛋白、权利要求19所述的人源化fcgr3a基因、权利要求20所述的细胞、组织或器官的应用，其特征在于，所述应用包含：

技术总结
本发明提供一种表达人或人源化(例如，人源化)FCGR3A蛋白的非人动物及其使用方法。

技术研发人员：刘潇,牛振岚,吕锐利
受保护的技术使用者：百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5