一种基于RPA检测间日疟原虫的引物探针组合、检测试剂盒及应用的制作方法

本发明属于生物检测领域，具体来说是一种基于rpa恒温扩增技术和侧流层析试纸相结合，用于检测间日疟原虫的引物探针组合、检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、疟疾是一种严重危害人类健康的虫媒传染病，广泛流行于热带、亚热带发展中国家。尽管经过多年努力，疟疾流行得到了一定程度的控制，但全球疟疾形势依然严峻。

2、目前比较常用的疟疾诊断方法有：以镜检法为代表的传统病原学诊断方法；以免疫层析试纸(immunochromatographic trips，ict)为代表的免疫学诊断方法；以及以pcr为代表的核酸检测方法。镜检法具有检出率高，可以区分虫种、鉴定虫密度，价格低等优点，但也存在费时费力，对专业技术要求高，低密度感染容易漏检等缺点。免疫层析试纸条，优点是操作简便，耗时短，判断直观明确，不依赖专门仪器设备和专业技术经验。目前已有多种疟疾诊断的免疫试纸条产品问世并广泛在实验室和现场使用，如carestart、wondfo、binaxnow等。但这些产品都只能区分恶性疟和非恶性疟，不能区分其他三种人体疟原虫(间日疟、卵形疟、三日疟)，同时对于低密度感染的样品敏感性较低，给基层现场的诊断带来了不便，不利于病人的对症治疗和流行病控制策略的及时制定和实施。核酸检测近年来已经广泛应用于多种病原体的检测，进一步发展而成的实时荧光pcr、巢氏pcr、多重pcr等技术检测，敏感性、特异性高，同时可以区分虫种，但缺点是检测过程时间长，必须依赖昂贵的仪器，对操作人员技术要求高，不适合现场应用。

3、近年来核酸等温扩增技术发展迅速，与传统的pcr技术相比，等温扩增技术使得核酸在恒温条件下得以扩增，摆脱了昂贵的热循环实验仪器，并且可在短时间内实现目的片段的指数扩增，使在多种非实验室条件下进行核酸扩增检测成为现实，尤其适用于现场应用。在多种等温扩增技术中，重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymeraseamplification，rpa)以t4噬菌体核酸复制机制为原理，可在恒温条件下(37℃～42℃)实现对核酸的快速、特异性扩增，且能够在20min内将核酸扩增至可检测水平，具有高敏感性和特异性。rpa结合胶体金侧流层析试纸条(lateral flow dipstick，lfd)具有敏感特异、操作简便、快速和可肉眼观察检测结果等优点。rpa-lfd目前已用于血吸虫、巴贝斯虫、隐孢子虫、旋毛虫等多种寄生虫的检测，具有广泛的应用前景。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供一种基于rpa恒温扩增技术和侧流层析试纸相结合的检测方法，用于检测间日疟原虫的引物探针组合、检测试剂盒及其应用，所述的这种基于rpa检测间日疟原虫的引物探针组合、检测试剂盒要解决现有间日疟原虫核酸诊断操作复杂、耗时长及成本高昂的技术问题。

2、本发明提供了一种基于rpa检测间日疟原虫的引物、探针组合，该引物、探针组合根据间日疟原虫ssu rrna基因序列设计，上游引物核苷酸序列如seq id no：1所示，下游引物核苷酸序列如seq id no：2所示，探针的核苷酸序列如seq id no：3所示。

3、进一步的，在下游引物5’端修饰biotin，探针的5’端和3’端分别修饰fam、c3spacer，在距离探针3’端15nt的位置修饰dspacer。

4、具体如下所示：

5、上游引物核苷酸序列：5’-tgttgcagttaaaacgctcgt-3’

6、下游引物核苷酸序列：5’-biotin-gctttgaacactctaatttactcaaag-3’

7、探针核苷酸序列：5’-6-fam-atcgatattttaagcaacgcttctagcttaat/dspacer/ccacataa ctgata-c3 spacer-3’。

8、其中biotin是生物素，fam是荧光素，用来作为胶体金核酸试条识别捕获的探针分子。c3 spacer是聚合酶延伸阻断基团，dspacer是取代核苷酸的一种碱基内核苷酸类似物，引入到寡核苷酸序列中的间臂修饰，c3 spacer目的是阻断核酸扩增，dspacer是核酸内切酶nfo的切割位点。只有当探针能够结合到扩增模板上时，dspacer位点的thf残基才会被nfo酶切割，进而继续扩增产生两端分别被fam和biotin修饰的扩增产物。

9、本发明还提供了一种基于rpa检测间日疟原虫的试剂盒，包括一个检测rpa扩增结果的侧流层析试纸，所述侧流层析试纸包括一个样品垫，所述的样品垫的一端紧密连接于含有胶体金标记探针的胶体金垫的一端，所述的胶体金垫的另外一端与纤维素膜的一端紧密连接，所述的纤维素膜的另外一端紧密连接吸水垫的一端，所述胶体金标记探针是由胶体金标记的可以与下游引物标记的生物素形成受体-配体特异性结合的链霉亲和素探针(streptavidin，sa)组成；所述纤维素膜上靠近胶体金探针垫的一端设置一条检测线，由可以与探针标记荧光素特异性结合的抗荧光素抗体组成，在检测线和吸水垫之间的纤维素膜上设置一条质控线，所述的质控线由特异性结合所述胶体金标记探针抗链霉亲和素抗体组成。

10、进一步的，上述的一种基于rpa检测间日疟原虫的试剂盒，包括一个rpa反应系统，rpa反应系统由四部分构成，

11、1)冻干试剂，包括重组酶、单链dna结合蛋白、聚合酶、核酸内切酶nfo、dntps、三磷酸腺苷；在所述的rpa反应系统中，重组酶的终浓度为200

12、ng/μl、单链dna结合蛋白的终浓度为508ng/μl、聚合酶的终浓度为160ng/μl、核酸内切酶nfo的终浓度为50ng/μl、dntps的终浓度为4mm、三磷酸腺苷的终浓度为5mm；

13、2)再水合缓冲液，包括tris缓冲液、磷酸肌酸、肌酸激酶、二硫苏糖醇、聚乙二醇；在所述的再水合缓冲液中，tris缓冲液的浓度为100mm、磷酸肌酸的浓度为100mm、肌酸激酶的浓度为200ng/μl、二硫苏糖醇的浓度为10mm、聚乙二醇的浓度为0.1092g/ml；

14、3)反应引发剂醋酸镁(mgoac)，所述的醋酸镁的浓度为140mm；

15、4)上述的引物探针组合物。

16、进一步的，rpa扩增反应体系为：取10μm的上、下游引物各2.1μl、10μm的探针0.6μl、再水合缓冲液29.5μl、醋酸镁2.5μl、dna模板2μl、无核酸酶水11.2μl，将上述混合液加入一个含所述的冻干试剂的扩增反应管中。

17、本发明还提供了一种基于rpa检测间日疟原虫的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

18、a.dna提取：利用血液dna提取试剂盒提取患者血样中的dna；

19、b.rpa扩增：利用权利要求5所述试剂盒对提取到的dna进行rpa扩增反应；rpa扩增的反应条件为：将上、下游引物、探针、再水合缓冲液及无核酸酶水混匀后，加入含有冻干试剂的反应管中，待完全溶解后，加入待检测dna模板，离心后，将醋酸镁滴加在反应管侧壁，再次离心后，将反应管于39℃金属浴孵育4min后取出反应管，上下颠倒混匀3-5次，离心后再置于39℃金属浴中孵育8-15min；

20、c.lfd检测：反应结束后，将反应液滴加在所述侧流层析试纸上进行检测，

21、根据试纸检测线和质控线的条带显示情况判断是否感染间日疟原虫。

22、具体的，所述纤维素膜可以是硝酸纤维素膜(nc膜)或醋酸纤维素膜或混合膜；所述胶体金探针垫为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜；所述样品垫可以是玻璃纤维或聚酯纤维或混合纤维；所述吸水垫由吸水材料制备，如吸水纸。

23、具体的，所述纤维素膜宽度控制在20～30mm；所述吸水垫的宽度为20～40mm，所述胶体金探针垫的宽度为5～10mm；所述样品垫宽度为10～40mm。

24、进一步的，所述的检测线上的抗荧光素抗体工作浓度为0.1～2.0mg/ml，喷涂量为0.5～1μl/cm；所说的质控线兔抗链霉亲和素抗体工作浓度为0.1～2.0mg/ml，喷涂量为0.5～1μl/cm；胶体金标记的链霉亲和素探针的工作浓度(以蛋白浓度计)为10～60μg/ml，喷涂量为40～50μl/cm。

25、进一步的，所述的侧流层析试纸背面设置一个起支撑作用的背板，背板材料的选择是多种多样的，可以是塑料板，如聚氯乙烯板(pvc)等。

26、本发明公开了一种基于rpa检测间日疟原虫的引物、探针组合，该组合包含根据间日疟原虫ssu rrna基因序列设计的上游引物、下游引物和探针，探针为3’端阻断的寡聚核苷酸，非末端位置还含有核酸内切酶nfo识别位点；探针的5’端标记第一标记物，下游引物的5’端标记第二标记物，第一标记物和第二标记物与不同的分子特异性结合。在本发明中，两个标记为分别为生物素(biotin)和荧光素(6-fam)。

27、本发明在检测过程中，一旦被检测样品中含有间日疟ssu rrna模板，就会在rpa恒温扩增系统中进行复制与扩增，扩增产物的两端分别含有生物素与荧光素的标记物。

28、将扩增产物用本发明所述侧流层析试纸进行检测，所述试纸采用胶体金标记的链霉亲和素作为检测探针，附着于胶体金探针垫上。检测过程中，复溶的胶体金标记探针可以与扩增出的间日疟ssu rrna核酸片段上标记的生物素进行受体-配体特异性结合，形成复合物，在毛细作用动力下层析到纤维素膜上。

29、本发明所述侧流层析试纸将抗荧光素抗体固定在纤维素膜上，形成一条检测线。当扩增出的核酸片段探针复合物流过检测线时，固定在纤维素膜上的抗荧光素抗体会捕获核酸探针复合物上标记的荧光素，从而形成肉眼可见的沉淀线(色带)。

30、本发明将可与检测探针特异性结合的抗体固定在纤维素膜上作为质控线。胶体金标记探针是链霉亲和素(streptavidin，sa)，相应的质控线采用兔抗链霉亲和素的多克隆抗体。无论待检样品中是否含有间日疟ssu rrna的扩增产物，本发明的诊断试条质控线位置总能形成色带，该条色带是判定检测过程是否正常和诊断试条是否变质的标准。

31、本发明的免疫层析试条具有以下优点：

32、(1)本发明基于核酸等温扩增技术，对低密度感染敏感性及特异性高：实验室考核结果显示，本发明所述基于rpa检测间日疟原虫的试剂盒的敏感性为

33、100.00％，特异性为100.00％。

34、(2)检测方法简单，检测过程中不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，检测时间短，半小时左右迅速观察结果，很适合现场和基层使用；适合野外快速检测。

35、(3)稳定性好，易于保存。成本低廉，易于进行工业化生产。本发明将在疟原虫诊断和治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。

技术特征：

1.一种基于rpa检测间日疟原虫的引物探针组合，其特征在于：上游引物核苷酸序列如seq id no：1所示，下游引物核苷酸序列如seq id no：2所示，探针的核苷酸序列如seq idno：3所示。

2.根据权利要求1所述的一种基于rpa检测间日疟原虫的引物探针组合，其特征在于：在下游引物5’端修饰biotin，探针的5’端和3’端分别修饰fam、c3 spacer，在距离探针3’端15nt的位置修饰dspacer。

3.一种基于rpa检测间日疟原虫的试剂盒，包括一个检测rpa扩增结果的侧流层析试纸，所述侧流层析试纸包括一个样品垫，所述的样品垫的一端紧密连接于含有胶体金标记探针的胶体金垫的一端，所述的胶体金垫的另外一端与纤维素膜的一端紧密连接，所述的纤维素膜的另外一端紧密连接吸水垫的一端，其特征在于：所述胶体金标记探针是由胶体金标记的可以与下游引物标记的生物素形成受体-配体特异性结合的链霉亲和素探针组成；所述纤维素膜上靠近胶体金探针垫的一端设置一条检测线，由可以与探针标记荧光素特异性结合的抗荧光素抗体组成，在检测线和吸水垫之间的纤维素膜上设置一条质控线，所述的质控线由特异性结合胶体金标记探针抗链霉亲和素抗体组成。

4.根据权利要求3所述的一种基于rpa检测间日疟原虫的试剂盒，其特征在于：试纸背面设置一个起支撑作用的背板。

5.根据权利要求3所述的一种基于rpa检测间日疟原虫的试剂盒，其特征在于：包括一个rpa反应系统，rpa反应系统由四部分构成，

6.根据权利要求3所述的一种基于rpa检测间日疟原虫的试剂盒，其特征在于rpa扩增反应体系为：取10μm的上、下游引物各2.1μl、10μm的探针0.6μl、再水合缓冲液29.5μl、醋酸镁2.5μl、dna模板2μl、无核酸酶水11.2μl，将上述混合液加入一个含所述的冻干试剂的扩增反应管中。

7.权利要求3所述的一种基于rpa检测间日疟原虫的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了一种基于RPA检测间日疟原虫的引物探针组合、检测试剂盒和应用。该组合物包含上游引物、下游引物和探针，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明基于RPA检测间日疟原虫的引物探针组合结合侧流层析试纸条检测法，建立了一种间日疟原虫的RPA‑LFD检测方法。本发明具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，能够实现短时间内结果可视，满足现场样本的检测要求；且不需要精密仪器，适合野外快速检测。

技术研发人员：李诗慧,石锋,高春花,丁丹,孙亚萍,危芙蓉,张璟,贾孝凯,王颖,朱慧慧
受保护的技术使用者：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所（国家热带病研究中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5