一种唾液联合乳杆菌LZZAY01的胞外囊泡LsEVs及其在结肠癌中的应用

本发明涉及一种唾液联合乳杆菌lzzay01的胞外囊泡lsevs及其在结肠癌中的应用，属于微生物。

背景技术：

1、结肠癌是全球发病率和死亡率较高的消化道恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。结肠癌通常是由肠道微生物群、黏膜屏障、环境、免疫系统等多重复杂因素相互作用的结果，其预防和治疗均面临着巨大的挑战。近年来，益生菌、宿主以及肠道微生物群之间的相互作用关系逐渐明晰。通过口服益生菌正向调节肠道微生物群、增强肠道黏膜屏障、竞争性抑制或清除致病菌等治疗手段获得了众多研究学者的认可。然而，大多数益生菌口服后难以耐受恶劣的胃酸环境，致使运送至肠道的有效活菌数量得不到保障。

2、益生菌胞外囊泡（extra cellular vesicles, evs）可以被视为一种安全有效的通信载体为益生菌提供有益的效果益，生菌胞外囊泡（extra cellular vesicles, evs）可以携带其菌体生物活性成分，穿过黏液层并直接迁移到其他组织或与宿主免疫系统的不同细胞相互作用，进而发挥生物学功能。因此益生菌衍生的evs有望成为一种新的、安全的治疗结肠癌策略应用于临床。

3、然而，目前并没有关于益生菌胞外囊泡（extra cellular vesicles, evs）的研究，基于此，我们研发了唾液联合乳杆菌lzzay01的胞外囊泡lsevs及其在结肠癌中的应用。

技术实现思路

1、一种唾液联合乳杆菌lzzay01的胞外囊泡lsevs，所述唾液联合乳杆菌lzzay01从新疆黑鸡唾液中分离得到，其保藏号为cgmcc no:28400，保藏日期为：2023年9月8日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，16s rdna序列如seq id no:1所示，分类命名为唾液联合乳杆菌(ligilactobacillus salivarius)，所述胞外囊泡lsevs由唾液联合乳杆菌lzzay01分泌得到；所述胞外囊泡lsevs的粒径为100-300nm的球形双层膜结构。

2、而且，所述胞外囊泡lsevs采用细菌膜囊泡分离试剂盒（dlmbiotech，bacmv10-20）提取，提取方法如下：

3、s1、收集细菌培养上清液

4、（1）、挑取唾液联合乳杆菌lzzay01单菌落于mrs肉汤中，置于恒温摇床摇菌10-14h，收集菌液，5000×g、4℃离心15-25min，得到一次上清液；

5、（2）、取一次上清液再次5000×g、4℃离心15-25min，得到二次上清液；

6、（3）、将二次上清液中加入0.5m/l naoh调ph至7.0-7.4，得到调ph二次上清液，-20℃储存；

7、s2、 胞外囊泡lsevs树脂捕获

8、（1）、取10ml调ph二次上清液，加入结合缓冲液1.0ml，混合均匀，加入400μl结合树脂混合混匀，10-20min后1500×g、离心1.5-2.5min得到三次上清液；

9、（2）、吸取400μl结合树脂，加入上述三次上清，室温颠倒混匀15min后，1，500×g室温离心2min。用移液器取离心后的上清液400μl（不弃），小心倒掉剩余上清，用移液器中的400μl上清液轻轻吹起树脂，转移至纯化柱，静置1.5-2.5min，2000×g、离心1.5-2.5min，弃去滤液，将纯化柱放回收集管；

10、s3、胞外囊泡lsevs洗涤

11、取500μl洗涤液加到纯化柱中，静置3min，3000×g、离心1.5-2.5min，弃去滤液，重复洗涤一次；

12、s4、胞外囊泡lsevs洗脱

13、将纯化柱放入低吸附蛋白的1.5ml离心管中，加入400μl洗脱液，静置5min，离心1.5-2.5min，将滤液转移至纯化柱中，室温静置3-8min，离心1.5-2.5min，离心所得液体即为胞外囊泡lsevs浓缩液。

14、而且，所述步骤s1（1）中，恒温摇床的温度为37℃、转速为200rpm。

15、另一方面，本发明提供一种唾液联合乳杆菌lzzay01的胞外囊泡lsevs的应用，应用于治疗结肠癌。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

17、本发明研发了唾液联合乳杆菌lzzay01的胞外囊泡，在体内外实验中观察到其抗结肠癌功能，并且在体外促进正常肠上皮细胞生长，这为益生菌胞外囊泡（extra cellularvesicles, evs）在抗癌抑癌中的应用中提供了新的思路和途径。

技术特征：

1.一种唾液联合乳杆菌lzzay01的胞外囊泡lsevs，所述唾液联合乳杆菌lzzay01从新疆黑鸡唾液中分离得到，其保藏号为cgmcc no:28400，保藏日期为：2023年9月8日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，16s rdna序列如seq id no:1所示，其特征在于，所述胞外囊泡lsevs由唾液联合乳杆菌lzzay01分泌得到，所述胞外囊泡lsevs的粒径为100-300nm的球形双层膜结构。

2.如权利要求1所述的一种唾液联合乳杆菌lzzay01的胞外囊泡lsevs，其特征在于，所述胞外囊泡lsevs的提取方法如下：

3.如权利要求2所述的一种唾液联合乳杆菌lzzay01的胞外囊泡lsevs，其特征在于，所述步骤s1（1）中，恒温摇床的温度为37℃、转速为200rpm。

4.如权利要求1-3任一项所述的一种唾液联合乳杆菌lzzay01的胞外囊泡lsevs的应用。

5.如权利要求4所述的一种唾液联合乳杆菌lzzay01的胞外囊泡lsevs的应用，其特征在于，用于治疗结肠癌。

技术总结
本发明提供一种唾液联合乳杆菌LZZAY01的胞外囊泡LsEVs及其在结肠癌中的应用，所述唾液联合乳杆菌LZZAY01从新疆黑鸡唾液中分离得到，所述胞外囊泡LsEVs由唾液联合乳杆菌LZZAY01分泌得到，所述胞外囊泡LsEVs的粒径为100‑300nm的球形双层膜结构；本发明研发了唾液联合乳杆菌LZZAY01的胞外囊泡，在体内外实验中观察到其抗结肠癌功能，并且在体外促进正常肠上皮细胞生长，这为益生菌胞外囊泡在抗癌抑癌中的应用中提供了新的思路和途径。

技术研发人员：赵鹏伟,杨文红,安世祥,崔珈衔,崔燕,李涛,陈荣,张明昱,张烜,陆景坤
受保护的技术使用者：内蒙古医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5