一种耐高温碱性α-半乳糖苷酶突变体及其制备方法

本发明涉及酶工程和基因工程，特别涉及一种耐高温碱性α-半乳糖苷酶突变体及其制备方法。

背景技术：

1、α-半乳糖苷酶即蜜二糖酶(1,6-α-d-galactoside galactohydrolase；ec3.2.1.22)，是水解α-半乳糖苷键的一种外切糖苷酶，能专一性催化多糖、糖脂、糖蛋白中糖链末端的α-1,6半乳糖苷键水解，不仅能水解棉籽糖和水苏糖等低聚糖，还能水解含α-半乳糖苷的杂多糖，从而在糖类代谢中起到重要作用，帮助分解复杂的多糖为可吸收的单糖。其独特的三维结构包含特定的催化活性位点，使其能够高效地识别和催化底物。α-半乳糖苷酶的应用范围非常广泛，尤其在食品工业中，它能有效分解豆类和其他富含半乳糖苷的食物，帮助减少消化不良和胀气；在生物医药领域，α-半乳糖苷酶被用于治疗遗传性疾病，如高半乳糖血症，针对这种疾病的替代疗法，已开发出基于α-半乳糖苷酶的药物，帮助患者更好地代谢半乳糖；此外，该酶在生物燃料生产中也起到关键作用，通过转化植物原料中的复杂糖为可发酵糖，提高生物燃料的产量。

2、目前，α-半乳糖苷酶的商品化已经形成了完整的产业链，包括从微生物发酵到酶制剂的生产，再到市场推广和应用，涵盖了食品添加剂、医药产品及生物技术领域的多种应用。这些商品化的产品，不仅推动了相关产业的发展，也为消费者提供了更多健康选择。随着对其功能和应用的深入研究，未来α-半乳糖苷酶的市场潜力将更加巨大。

3、α-半乳糖苷酶广泛存在于多种微生物中，其主要来源包括细菌(巴氏杆菌和大肠杆菌)、真菌(曲霉属)和酵母，α-半乳糖苷酶的耐高温和耐碱性特性在不同来源的微生物中有所不同。通常来源于嗜热菌的α-半乳糖苷酶在50℃至75℃范围内表现出良好的活性，部分酶能够在ph 6至8的中性至弱碱性环境中保持最佳活性，但是在ph 9或更高的条件下酶活性降低。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一目的是提供一种同时耐高温耐高碱性的α-半乳糖苷酶突变体；本发明的第二目的为提供所述α-半乳糖苷酶突变体的制备方法。

2、技术方案：本发明所述的耐高温碱性α-半乳糖苷酶突变体，所述突变体对来源于嗜维生素无氧芽孢杆菌的α-半乳糖苷酶进行定点突变，将seq id no.1所示氨基酸序列第444位、第457位、第509位这三个位点中至少有一个氨基酸进行置换；第444位天冬酰胺asn突变为苯丙氨酸phe，第457位天冬氨酸asp突变为甲硫氨酸met，第509位精氨酸arg突变为色氨酸trp。

3、优选的，所述突变体包括所述突变体包括所述突变体包括n444f、d457m、r509w、、d457m/r509w或n444f/d457m/r509w。

4、所述野生型α-半乳糖苷酶来自嗜维生素无氧芽孢杆菌(anoxybacillusvitaminiphilus wmf1)，氨基酸序列为seq id no.1，基因序列为：seq id no.2。

5、所述突变体n444f，即第444位天冬酰胺asn突变为苯丙氨酸phe。

6、所述突变体d457m，即第457位天冬氨酸asp突变为甲硫氨酸met。

7、所述突变体r509w，即第509位精氨酸arg突变为色氨酸trp。

8、所述突变体d457m/r509w，即第457位天冬氨酸asp突变为甲硫氨酸met，且第509位精氨酸arg突变为色氨酸trp。

9、所述突变体n444f/d457m/r509w，即第444位天冬酰胺asn突变为苯丙氨酸phe，第457位天冬氨酸asp突变为甲硫氨酸met和第509位精氨酸arg突变为色氨酸trp。

10、本发明所述的核苷酸序列，为编码上述α-半乳糖苷酶突变体蛋白的基因序列。

11、本发明所述载体，包含上述的核苷酸序列。所述载体能够扩增或表达所述核苷酸序列。

12、所述载体包括克隆载体或表达载体。载体可以为质粒或病毒等

13、本发明所述重组菌，包含上述的核苷酸序列或者上述的载体。

14、优选的，所述宿主菌为e.coli dh5α。

15、本发明所述α-半乳糖苷酶突变体的制备方法，包括如下步骤：

16、(1)以α-半乳糖苷酶基因为模板，用点突变引物进行pcr反应得到α-半乳糖苷酶突变基因；

17、(2)将α-半乳糖苷酶突变基因插入表达载体，后转入宿主细胞中获得重组细胞；

18、(3)收集表达α-半乳糖苷酶突变体的重组细胞，重悬菌体后破碎细胞，离心取上清即得含有α-半乳糖苷酶突变体的粗酶液。

19、优选地，通过计算机建模，预测出原始α-半乳糖苷酶的3d模型，并设计相关突变位点的引物。所述点突变引物如表1：

20、表1点突变引物

21、

22、

23、引物中下划线标记的为突变位点。

24、所述pcr反应的体系如表2：

25、表2pcr反应体系

26、

27、pcr反应的条件如表3：

28、表3pcr反应条件

29、

30、优选的，步骤(2)中，所述将α-半乳糖苷酶突变基因插入表达载体使用dna同源重组方法。

31、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)通过对嗜维生素无氧芽孢杆菌(anoxybacillus vitaminiphilus wmf1)来源的α-半乳糖苷酶进行定点突变，获得α-半乳糖苷酶突变体具有良好的热稳定性和碱稳定性，在ph 11的缓冲液中，95℃高温处理2h，酶突变体催化α-半乳糖苷键水解的能力均有明显提升，酶突变体的比酶活相比原始酶提高了635％；(2)α-半乳糖苷酶突变体增加了α-半乳糖苷酶在更宽的ph和更高的温度条件下的可用性，对提高乳糖加工产业中的原料利用率和产品质量、降低生产成本具有显著效果，满足了能源、食品和饲料等领域中对于耐酸性α-半乳糖苷酶的需求，具有重要的社会和经济效益，应用前景广阔。

技术特征：

1.一种耐高温碱性α-半乳糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体对来源于嗜维生素无氧芽孢杆菌的α-半乳糖苷酶进行定点突变，将seq id no.1所示氨基酸序列第444位、第457位、第509位这三个位点中至少有一个氨基酸进行置换；第444位天冬酰胺asn突变为苯丙氨酸phe，第457位天冬氨酸asp突变为甲硫氨酸met，第509位精氨酸arg突变为色氨酸trp。

2.根据权利要求1所述α-半乳糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体包括n444f、d457m、r509w、d457m/r509w或n444f/d457m/r509w。

3.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为编码权利要求1或2所述α-半乳糖苷酶突变体蛋白的基因序列。

4.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的核苷酸序列。

5.根据权利要求5所述载体，其特征在于，所述载体包括克隆载体或表达载体。

6.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包含权利要求3所述的核苷酸序列或者权利要求4所述的载体。

7.根据权利要求6所述重菌，其特征在于，所述宿主菌为e.coli dh5α。

8.一种权利要求1所述α-半乳糖苷酶突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述将α-半乳糖苷酶突变基因插入表达载体使用dna同源重组方法。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引物为：

技术总结
本发明公开了一种耐高温碱性α‑半乳糖苷酶突变体及其制备方法，所述突变体对来源于嗜维生素无氧芽孢杆菌的α‑半乳糖苷酶进行定点突变，将SEQ ID No.1所示氨基酸序列第444位、第457位、第509位这三个位点中至少有一个氨基酸进行置换；第444位天冬酰胺Asn突变为苯丙氨酸Phe，第457位天冬氨酸Asp突变为甲硫氨酸Met，第509位精氨酸Arg突变为色氨酸Trp。本发明通过对嗜维生素无氧芽孢杆菌(Anoxybacillus vitaminiphilus WMF1)来源的α‑半乳糖苷酶进行定点突变，获得α‑半乳糖苷酶突变体具有良好的热稳定性和碱稳定性。

技术研发人员：任鑫坤,程冰洁,余克洋,屈展,吴怡菲,李志恒,王天奇
受保护的技术使用者：南京大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5