一种利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法
本发明涉及低分子透明质酸寡糖，具体涉及一种利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法。
背景技术：
1、透明质酸(hyaluronic acid，ha)是一种天然的高分子酸性黏多糖，广泛存在于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中，由n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)和d-葡萄糖醛酸(glca)二糖重复单位通过β-1,4-糖苷键和β-1,3-糖苷键构成。透明质酸因其良好的生物相容性和生物降解性，被广泛应用于生物医学领域，如组织工程、药物输送、伤口愈合等。然而，透明质酸的生物活性与其分子量的大小密切相关，分子量越小生物活性越高。
2、透明质酸寡糖(o-ha)属于小分子多糖,其性质与普通ha有很大不同 ,甚至具有完全相反的作用。透明质酸寡糖(单糖残基数量为2-40，一般为4-16)表现出非常强的生物活性，具有促进创口愈合、促进骨和血管生成、逆转肿瘤细胞耐药性等作用，且易于渗透到真皮中。因此，透明质酸寡糖在食品保健、化妆品及临床医疗领域有广阔的应用前景。
3、由于生物酶法具有条件温和，操作简便，专一性强，能特异性地降解化学键而不对其他分子基团产生影响，效率较高等优势，可通过控制加酶量及反应时间得到均一的不同分子量透明质酸，因此，生物酶法是制备低分子量透明质酸寡糖最理想的方法。
4、现有技术中，透明质酸酶主要通过微生物发酵后，经过多步纯化获得。目前微生物来源的透明质酸酶的表达方式主要分为两种，一种是胞外分泌表达，如酵母、芽胞杆菌发酵产透明质酸酶等；一种是胞内表达，如柠檬酸杆菌、大肠杆菌发酵产透明质酸酶等。
5、中国专利cn117448305a公开了一种酵母发酵产水蛭透明质酸酶的方法及其应用，该发明将发酵液离心取上清，经洗脱纯化蛋白，收集洗脱峰得到粗酶液，然后经纯化后得到纯酶液。该方法虽然无需进行高压破碎，对离心后的发酵上清液中直接纯化，但是酵母发酵周期较长，需10-15天，增加了时间和人工成本。
6、中国专利cn118086255a公开了一种重组透明质酸酶的制备方法及其应用，该发明对发酵后的重组菌的发酵液先离心收集菌泥，菌泥重悬后进行破碎，将破碎液离心后取上清液，经镍柱亲和层析法进行层析纯化，收集洗脱峰，然后经过浓缩换液，得到透明质酸酶酶液。该方法虽然最后得到高酶活的透明质酸酶，但是需要使用高压均质机进行菌体破碎，在层析纯化中还需要借助蛋白纯化系统等高端设备，工艺繁琐。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法，本发明的方法无需进行菌体破碎，无需进行层析纯化，发酵周期短，制备工艺简单，成本较低，适合大规模工业化生产。
2、为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：
3、一种利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法，包括：制备全细胞催化酶液，酶解反应，后处理；
4、所述制备全细胞催化酶液，将重组大肠杆菌菌泥按加入重悬buffer进行菌泥重悬，得到全细胞催化酶液；
5、所述制备全细胞催化酶液中，菌泥重悬时的菌浓为1:8-12；
6、所述重组大肠杆菌菌泥为按照中国专利cn116286764b 一种透明质酸裂解酶及其重组菌与应用的方法得到的重组菌；
7、所述重悬buffer的成分为：25mm磷酸盐缓冲液，500mm nacl，ph为7.4；
8、所述酶解反应，将纯水加热至36-38℃，加入全细胞催化酶液、透明质酸钠底物，在密封条件下，在36-38℃下进行酶解反应，得到酶解液；
9、所述酶解反应中，所述全细胞催化酶液与纯水的体积比为30-40:2000；
10、所述透明质酸钠底物与纯水的质量体积比为200-300g:2l；
11、所述后处理，包括：微滤，有机超滤膜分离，冷冻干燥；
12、所述微滤，对酶解液进行微滤处理，得到微滤液；
13、所述微滤中，微滤处理时使用的微滤装置的制备方法为：将型号为335的纸板放入布氏漏斗，然后铺一层硅藻土；
14、所述有机超滤膜分离，使用有机超滤膜对微滤液进行分离，待透过液的固含量在5%以上时，收集透过液；
15、所述有机超滤膜分离中，有机超滤膜的过滤精度为1wda；
16、所述有机超滤膜分离的温度为30-35℃，压力为0.4-0.5mpa；
17、所述冷冻干燥，对透过液进行冷冻干燥，得到低分子透明质酸寡糖。
18、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
19、（1）本发明的利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法，无需进行菌体破碎，也无需进行层析纯化，对发酵后离心收集的菌泥仅需进行一步重悬，即可获得全细胞催化酶液，该全细胞催化酶液所用的菌体为重组大肠杆菌，可直接用于酶切大分子透明质酸钠，制备低分子量透明质酸寡糖，包括不饱和透明质酸二糖、不饱和透明质酸四糖、不饱和透明质酸六糖、不饱和透明质酸八糖，完全降解后终产物为不饱和透明质酸二糖；制备工艺简单，成本较低，适合大规模工业化生产；
20、（2）本发明的利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法，得到的低分子透明质酸寡糖的外观符合规定，含量为99.04-99.82%，平均相对分子量符合规定，溶液透光度为99.89-99.99%，干燥失重为3.11-4.31%，ph值为6.6-6.8，蛋白质含量为0.03-0.04%。
技术特征：
1.一种利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法，其特征在于，包括：制备全细胞催化酶液，酶解反应，后处理；
2.根据权利要求1所述的利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法，其特征在于，所述制备全细胞催化酶液中，菌泥重悬时的菌浓为1:8-12。
3.根据权利要求1所述的利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法，其特征在于，所述制备全细胞催化酶液中，所述重悬buffer的成分为：25mm磷酸盐缓冲液，500mmnacl，ph为7.4。
4.根据权利要求1所述的利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法，其特征在于，所述酶解反应中，所述全细胞催化酶液与纯水的体积比为30-40:2000；
5.根据权利要求1所述的利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法，其特征在于，所述后处理，包括：微滤，有机超滤膜分离，冷冻干燥。
6.根据权利要求1所述的利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法，其特征在于，所述微滤，对酶解液进行微滤处理，得到微滤液。
7.根据权利要求1所述的利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法，其特征在于，所述微滤中，微滤处理时使用的微滤装置的制备方法为：将型号为335的纸板放入布氏漏斗，然后铺一层硅藻土。
8.根据权利要求1所述的利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法，其特征在于，所述有机超滤膜分离，使用有机超滤膜对微滤液进行分离，待透过液的固含量在5%以上时，收集透过液；
9.根据权利要求1所述的利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法，其特征在于，所述冷冻干燥，对透过液进行冷冻干燥，得到低分子透明质酸寡糖。
技术总结
本发明公开了一种利用全细胞催化技术制备低分子透明质酸寡糖的方法，其特征在于，包括：制备全细胞催化酶液，酶解反应，后处理；所述制备全细胞催化酶液，将重组大肠杆菌菌泥按加入重悬Buffer进行菌泥重悬，得到全细胞催化酶液；所述酶解反应，将纯水加热至36‑38℃，加入全细胞催化酶液、透明质酸钠底物，在密封条件下，在36‑38℃下进行酶解反应，得到酶解液；本发明的方法无需进行菌体破碎，无需进行层析纯化，发酵周期短，制备工艺简单，成本较低，适合大规模工业化生产。
技术研发人员：康传利,褚洪官,史劲松,龚劲松,廉少杰,郑德强,刘磊,杜帅,汤丽伟,张美霞,刘蔷,赵玉雪
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5