特异性下丘脑POMC神经元SIRT1过表达小鼠模型构建方法及其应用与流程

本发明属于生物领域，涉及特异性下丘脑pomc神经元sirt1过表达小鼠模型构建方法及其应用。

背景技术：

1、zfns(锌指核酸酶)技术是第一代基因组编辑技术，效率低下且耗时费力。第二代基因编辑技术talen的出现，基因编辑效率大幅提高。talen是合成蛋白，对靶序列切割后可产生黏性突出端dsb。talen大大加快了基因编辑技术的发展，但在应用过程中，其复杂的蛋白设计、昂贵的成本和较高的难度，仍使基因编辑技术的广泛应用受限。第三代基因编辑技术crispr/cas9系统不需要设计复杂的dna结合蛋白以及dna结合蛋白与fok i核酸酶的融合过程。通过软件就可快速设计sgrna,并对其进行初步筛选。同时，通过改变sgrna中的一小段序列，crispr/cas9系统可快速实现对其他基因位点的编辑。

2、沉默调节蛋白1(sirtuin 1,sirt1)，是哺乳动物中与酵母沉默信息调节蛋白2(silencing information regulator2，sir2)高度同源的蛋白质，是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)的ⅲ类组蛋白去乙酰化酶(hdac)，在细胞分化、衰老、凋亡、dna损伤修复、能量及内分泌代谢调节中起重要作用，同时在基因沉默、表观遗传学修饰、转录调控及信号转导调节中发挥重要的生物学功能。但目前关于沉默调节蛋白1的研究较少，因此亟需提供一种sirt1过表达小鼠，通过现代基因工程技术干预小鼠体内sirt1的活性，用于研究sirt1基因的各种功能，例如细胞衰老、肿瘤发生发展、dna损伤修复、神经系统的发育等。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供特异性下丘脑pomc神经元sirt1过表达小鼠模型构建方法及其应用，本方案合理设计及修饰sgrna，保证了构建的同源重组载体的高特异性与低脱靶率。将需要进行编辑的目的基因及其载体通过显微注射的方式导入小鼠体内，实现目的基因的编辑能够稳定遗传，最终获得稳定遗传的基因编辑动物。

2、本发明提供的技术方案如下所示：

3、特异性下丘脑pomc神经元sirt1过表达小鼠模型构建方法，包括以下步骤：利用crispr/cas9技术，将cag-lsl-msirt1-3-3xflag-wpre-polya基因片段定点插入到小鼠的h11位点；重组后的小鼠的h11位点后的序列如seq id no.1所示。

4、进一步的，将crispr/cas9体系和同源重组载体显微注射到c57bl/6jgpt小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠；经pcr基因鉴定验证正确的f0代阳性小鼠与c57bl/6jgpt小鼠交配获得可稳定遗传的f1代阳性小鼠模型；将f1代小鼠与pomc-cre小鼠交配获得f2代小鼠并对其进行基因鉴定。

5、进一步的，构建携带靶位点同源区域及目的片段的同源重组载体；将转录好的sgrna和cas9系统以及纯化后的同源重组载体样品显微注射到c57bl/6jgpt小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠。

6、进一步的，所述同源重组载体的鉴定引物如下：

7、1213513-seqf1：tccccatcaagctgataaca；

8、1213513-seqr2：gctcaggtggaggaattgtt；

9、1213513-seqf5：ccaagcaacaaacaacaatg；

10、h11-3arm-tr：ctcaggacctctgaaagacc。

11、进一步的，sgrna的序列为5′-ctgagccaacagtggtagta-3′。

12、进一步的，f0代小鼠的鉴定引物如下：

13、h11-tf2：atgcccaccaaagtcatcagtgtag；

14、h11-cag-5tr2：aggcgggccatttaccgtaagtta；

15、wpre-tf1：tcaatccagcggaccttcctt；

16、h11-tr1：gacccactattctgcaccactcattag；

17、h11-wt-tf1a：agtctttcccttgcctctgct；

18、h11-wt-tr1a：gggtcttccacctttcttcag；

19、进一步的，f1代小鼠的鉴定引物如下：

20、h11-tf2：atgcccaccaaagtcatcagtgtag；

21、h11-cag-5tr2：aggcgggccatttaccgtaagtta；

22、wpre-tf1：tcaatccagcggaccttcctt；

23、h11-tr2：tcacagaaaccatatggcgctcc；

24、h11-wt-tf1a：agtctttcccttgcctctgct；

25、h11-wt-tr1a：gggtcttccacctttcttcag。

26、进一步的，f2代小鼠的鉴定引物如下：

27、wpre-tf1：tcaatccagcggaccttcctt；

28、h11-tr3：atatccccttgttccctttctgc；

29、h11-wt-tf1a：agtctttcccttgcctctgct；

30、h11-wt-tr1a：gggtcttccacctttcttcag；

31、oimr1084：gcggtctggcagtaaaaactatc；

32、oimr1085：gtgaaacagcattgctgtcactt。

33、本发明还提供上述方法构建的特异性下丘脑pomc神经元sirt1过表达小鼠模型在制备药物中的应用。

34、进一步的，所述药物为改善肥胖的药物。

35、有益效果

36、sirt1(sirtuin 1)是一种关键的蛋白质，属于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)依赖的组蛋白去乙酰化酶类，对细胞分化、衰老、凋亡、dna损伤修复等生理过程起着重要作用。

37、同时，sirt1可作为能量传感器，在控制身体代谢中发挥重要作用。在外周组织中，大量研究表明sirt1能够调节肝脏、胰腺、骨骼肌等器官的代谢进程。在中枢，下丘脑通过多个神经元回路的紧密协调在控制食物摄入和能量消耗方面发挥着关键作用。sirt1亦在下丘脑中表达，禁食后其表达增加。而下丘脑sirt1的急性抑制抑制了空腹诱导的大鼠食欲亢进。

38、由于sirt1在pomc神经元中表达，这一代谢传感器神经元中的这种代谢传感器蛋白可能在协调身体能量稳态中起关键作用。因此，本发明利用crispr/cas9技术，将cag-lsl-msirt1-3-3xflag-wpre-polya基因片段定点插入到小鼠的h11位点。sgrna的序列为5′-ctgagccaacagtggtagta-3′。将crispr/cas9体系和同源重组载体显微注射到c57bl/6jgpt小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠。经pcr验证正确的f0代阳性小鼠与c57bl/6jgpt小鼠交配获得可稳定遗传的f1代阳性小鼠模型。将f1代小鼠与b012339stocktg(pomc1-cre)16lowlj小鼠交配获得f2代小鼠并对其进行基因鉴定。基于crispr cas9系统，我们生成了下丘脑pomc神经元特异性sirt1过表达小鼠，研究该小鼠(以下简称oe小鼠)与其同窝对照小鼠(以下简称wt)在饮食诱导肥胖后体重、摄入、血糖的区别。7周喂养可见oe小鼠重于wt小鼠，但是两种小鼠的累积摄入量并没有统计意义的差异。同时，oe小鼠表现出葡萄糖耐量受损。

39、此外，在这过程中生成的h11-cag-lsl-msirt1-3×flag-wpre-polya小鼠即sirt1过表达小鼠能够与各种cre工具鼠配繁从而启动sirt1基因过表达，进而生成不同区域的sirt1过表达小鼠，从而用于研究sirt1基因的其他功能，例如细胞衰老、肿瘤发生发展、dna损伤修复、神经系统的发育等。

40、总之，通过现代基因工程技术干预小鼠体内sirt1的活性，对研究与sirtl功能密切相关的疾病具有重大科学意义和社会经济效益。

技术特征：

1.特异性下丘脑pomc神经元sirt1过表达小鼠模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：利用crispr/cas9技术，将cag-lsl-msirt1-3-3xflag-wpre-polya基因片段定点插入到小鼠的h11位点；重组后的小鼠的h11位点后的序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的特异性下丘脑pomc神经元sirt1过表达小鼠模型构建方法，其特征在于，将crispr/cas9体系和同源重组载体显微注射到c57bl/6jgpt小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠；经pcr验证正确的f0代阳性小鼠与c57bl/6jgpt小鼠交配获得可稳定遗传的f1代阳性小鼠模型；将f1代小鼠与pomc-cre小鼠交配获得f2代小鼠并对其进行基因鉴定。

3.根据权利要求2所述的特异性下丘脑pomc神经元sirt1过表达小鼠模型构建方法，其特征在于，构建携带靶位点同源区域及目的片段的同源重组载体；将转录好的sgrna和cas9系统以及纯化后的同源重组载体样品显微注射到c57bl/6jgpt小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠。

4.根据权利要求3所述的特异性下丘脑pomc神经元sirt1过表达小鼠模型构建方法，其特征在于，所述同源重组载体的鉴定引物如下：

5.根据权利要求1所述的特异性下丘脑pomc神经元sirt1过表达小鼠模型构建方法，其特征在于，sgrna的序列为5′-ctgagccaacagtggtagta-3′。

6.根据权利要求2所述的特异性下丘脑pomc神经元sirt1过表达小鼠模型构建方法，其特征在于，f0代小鼠的鉴定引物如下：

7.根据权利要求2所述的特异性下丘脑pomc神经元sirt1过表达小鼠模型构建方法，其特征在于，f1代小鼠的鉴定引物如下：

8.根据权利要求2所述的特异性下丘脑pomc神经元sirt1过表达小鼠模型构建方法，其特征在于，f2代小鼠的鉴定引物如下：

9.权利要求1～8任一项所述方法构建的特异性下丘脑pomc神经元sirt1过表达小鼠模型在制备药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物为改善肥胖的药物。

技术总结
本发明提供特异性下丘脑POMC神经元SIRT1过表达小鼠模型构建方法及其应用，本发明利用CRISPR/Cas9技术，将CAG‑LSL‑mSIRT1‑3‑3xFlag‑WPRE‑PolyA基因片段定点插入到小鼠的H11位点；重组后的小鼠的H11位点后的序列如SEQ ID NO.1所示。本方案合理设计及修饰sgRNA，保证了构建的同源重组载体的高特异性与低脱靶率。将需要进行编辑的目的基因及其载体通过显微注射的方式导入小鼠体内，实现目的基因的编辑能够稳定遗传，最终获得稳定遗传的基因编辑动物。

技术研发人员：方新宇,张向荣,张少童
受保护的技术使用者：南京脑科医院
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5