检测顶体结合蛋白ACRBP突变导致男性不育症的检测试剂和试剂盒的制作方法
本发明属于生殖医学，具体涉及检测顶体结合蛋白acrbp突变导致男性不育症的检测试剂和试剂盒，更具体的，本发明涉及一种分离的核酸、表达载体、重组细胞、标志物、检测试剂和试剂盒及其用途。
背景技术：
1、受精是人类繁殖成功的关键步骤，包括卵母细胞和精子的成熟、精子获能、超活化、顶体反应、精子与透明带结合、配子融合、卵子激活和精子解聚等多个阶段。任何一个阶段出现问题，都可能导致生育失败。其中，精子顶体异常是导致不明原因男性不育的主要原因之一。尽管此类患者的精液常规检查可能显示正常或仅有轻中度少弱精子症，但在体外受精中却可能完全受精失败或受精率低于30％。目前对于精子顶体异常的原因仍知之甚少，尚无准确预测精子是否存在顶体异常的方法。这导致患者长期不孕不育或体外受精失败，给他们和家庭带来巨大的心理压力和经济负担。
2、哺乳动物精子的顶体是位于头部顶端表面的帽状小泡，顶体小泡的腔室由内顶体膜和外顶体膜包围，内含可溶性和顶体基质成分。顶体反应是外顶体膜和卵母细胞质膜在多个部位融合的过程。顶体基质中定位的精子丝氨酸蛋白酶acrosin(acr)在顶体基质成分的分散中起着至关重要的作用。由于只有经历顶体反应的精子才能与卵母细胞质膜融合，顶体反应在生理上对于受精是必不可少的。顶体蛋白acrbp是acr前体(proacr)和中间形式的特异性结合蛋白。acrbp通常仅在睾丸中表达，但也在多种不同类型的肿瘤中表达，包括膀胱癌、乳腺癌、肝癌和肺癌。哺乳动物的acrbp最初在生精细胞中以约60kda的前体蛋白(acrbp-w)形式合成，在精子发生和/或附睾成熟过程中通过移除前体acrbp-w的n端后，产生32kda的成熟acrbp(acrbp-c)。acrbp敲除雄性小鼠表现出严重的生育力下降，主要由于顶体形成异常。虽然原顶体小泡可以正常组装，但早期精子细胞无法形成大型顶体颗粒，导致顶体结构破碎，进一步导致acrbp敲除雄性小鼠附睾精子的头部呈现异常圆形和运动能力下降。因此，acrbp在早期精子生成过程中将顶体颗粒形成和配置到顶体小泡中央起关键作用。因此，亟需开发一种与精子顶体异常导致的男性不育相关的检测试剂和相关试剂盒。
技术实现思路
1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种用于检测因精子顶体异常导致的男性不育的分离的核酸、标志物、检测试剂和试剂盒，该发明的分离的核酸可作为诊断精子顶体异常所致男性不育症的标志物，通过检测该标志物可有效诊断患者是否患有精子顶体异常所致男性不育症，且采用检测上述标志物的检测试剂和试剂盒，具有诊断特异性高、准确性高等优点。
2、本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
3、中国专利文献cn115074431a公开了iqcn作为靶标在诊断和治疗完全受精失败中的应用，所述iqcn的等位基因突变为c.1067c＞g、c.316a＞g和c.1892c＞a。该突变可以破坏iqcn蛋白的五个iq1结构域并导致c端序列丢失，导致人类精子的顶体缺陷，进而引起男性不育。中国专利文献cn115232198a本申请公开了一种多肽，所述多肽为iqcn蛋白截短体，所述iqcn蛋白截短体和受精失败的表型相关。以上发明均为男性受精障碍患者的基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询提供了一种有效的途径。
4、进一步地，发明人发现，顶体蛋白acrbp是与男性生殖功能相关的基因，其突变可能导致精子顶体异常。然而目前关于acrbp基因突变位点及其在精子顶体异常患者基因诊断中的用途还未见报道。
5、基于此，本发明的第一个方面，本发明提供了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述分离的核酸包括acrbp突变基因；其中，与如seq id no:1核苷酸序列所示的acrbp基因相比，所述acrbp突变基因的突变位点为c.1091t>c。根据本发明实施例的分离的核酸可作为诊断精子顶体异常所致男性不育症的标志物，通过检测该标志物可有效诊断患者是否患有精子顶体异常所致男性不育症。
6、根据本发明的实施例，所述的分离的核酸可作为诊断精子顶体异常所致男性不育症的标志物。
7、本发明的第二个方面，本发明提供了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带第一方面所述的分离的核酸。
8、本发明的第三个方面，本发明提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带发明第一方面所述的分离的核酸或者第二方面所述的表达载体。
9、根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将所述表达载体导入宿主细胞中获得。
10、本发明的第四个方面，本发明的第一个方面所述的分离的核酸在作为诊断精子顶体异常所致男性不育症的标志物中的用途。
11、本发明的第五个方面，本发明提供了一种标志物。根据本发明的实施例，所述标志物包括如下突变基因中的至少之一：acrbp突变基因，与如seq id no:1核苷酸序列所示的acrbp基因相比，所述acrbp突变基因的突变位点为c.1091t>c。本发明实施例的标志物可有效诊断患者是否患有精子顶体异常所致男性不育症，且采用检测上述标志物的检测试剂和试剂盒，具有诊断特异性高、准确性高等优点。
12、本发明的第六个方面，本发明提供了一种检测试剂。根据本发明的实施例，所述检测试剂包括发明第一方面所述的分离的核酸或发明第五方面所述的标志物的试剂。根据本发明实施例的检测试剂可有效诊断精子顶体异常所致男性不育症，具有诊断特异性高、准确性高等优点。
13、根据本发明的实施例，所述试剂为检测acrbp突变基因的引物组。
14、根据本发明的实施例，所述引物组包括如下引物对的至少之一：
15、上游引物gctggtgataaagatttggg和下游引物tagatacctggttgccgatg。
16、本发明的第七个方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括发明第六方面所述的检测试剂。根据本发明实施例的检测试剂可有效诊断精子顶体异常所致男性不育症，具有诊断特异性高、准确性高等优点。
17、根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括如下试剂中的至少之一：
18、dntp、taq酶和pcr反应缓冲液。
19、本发明的第八个方面，本发明提供了一种第六方面所述的检测试剂或者第七方面所述的试剂盒在制备诊断产品中的用途，所述诊断产品用于诊断精子顶体异常所致男性不育症。根据本发明实施例的检测试剂和试剂盒可有效诊断精子顶体异常所致男性不育症，具有诊断特异性高、准确性高等优点。
技术特征：
1.一种分离的核酸，其特征在于，包括acrbp突变基因；
2.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求1所述的分离的核酸。
3.一种重组细胞，其特征在于，携带权利要求1所述的分离的核酸或权利要求2所述的表达载体；
4.权利要求1所述的分离的核酸在作为诊断精子顶体异常所致男性不育症的标志物中的用途。
5.一种标志物，其特征在于，包括如下突变基因中的至少之一：
6.一种检测试剂，其特征在于，包括：
7.根据权利要求6所述的检测试剂，其特征在于，所述试剂为检测acrbp突变基因的引物组；
8.一种试剂盒，其特征在于，包括：
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括如下试剂中的至少之一：
10.权利要求6或7所述的检测试剂或者权利要求8或9所述的试剂盒在制备诊断产品中的用途，所述诊断产品用于诊断精子顶体异常所致男性不育症。
技术总结
本发明公开了一种分离的核酸和标志物以及用于检测标志物的检测试剂和试剂盒。分离的核酸和标志物包括ACRBP突变基因；其中，与如SEQ ID NO:1核苷酸序列所示的ACRBP基因相比，所述ACRBP突变基因的突变位点为c.1091T>C。本发明分离的核酸可作为诊断精子顶体异常所致男性不育症的标志物，本发明开发的检测标志物的试剂、试剂盒和生物制剂，能够快速有效的诊断顶体异常所致男性不育症。
技术研发人员：史庆华,张欢
受保护的技术使用者：合肥综合性国家科学中心大健康研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5