一种测定GLP-2类似物药物生物学活性的细胞的制作方法

本发明属于生物医药，具体地，本发明涉及一种测定glp-2类似物药物生物学活性的细胞，更具体地，本发明涉及一种稳定表达glp-2r的d9细胞及其在检测glp-2类似物药物生物学活性中的应用。

背景技术：

1、胰高血糖素样肽-2(glp-2)是由肠道l细胞分泌的一种分子量为3.9kda的单链多肽激素，属于胰高血糖素样肽(glp)家族的一员，在体内扮演着重要的角色。glp-2是一种特异性的肠上皮生长因子，具有促进肠黏膜损伤修复、抑制细胞凋亡、改善肠道对营养物质的吸收、增强肠道屏障功能等作用，对维持肠黏膜的连续性和完整性也有重要作用。

2、glp-2类似物是一种基于胰高血糖素样肽-2(glp-2)的类似物，具有潜在的治疗应用。其中，替度格鲁肽(又名替度鲁肽，度格鲁肽)是中国首个获批治疗短肠综合征的glp-2类似物，适用于成人和1岁及以上儿童患者。短肠综合征是一种罕见病，患者肠道有效吸收面积显著减少，导致营养吸收障碍和多种代谢紊乱。替度格鲁肽能够增加患者残余肠道绒毛高度和隐窝深度，促进消化道吸收功能恢复，帮助患者减少对肠外营养的依赖。此外，glp-2类似物还包括艾西糖肽、阿帕拉格鲁肽、glepaglutide。艾西糖肽能够增加细胞增殖，减少肠道细胞凋亡，在治疗胃肠道黏膜炎，包括化疗诱发的腹泻方面具有较大的应用潜力；在治疗短肠综合征(sbs)患者的ii期临床试验中，阿帕拉格鲁肽显示出能显著降低患者对肠外营养支持的依赖性，其作为一种潜在的治疗罕见肠胃道疾病的新疗法，具有广阔的应用前景；glepaglutide主要用于炎症性肠病(ibd)和克罗恩病的研究，也被开发作为短肠综合症(sbs)的潜在治疗选择。

3、以往对于glp-2类似物的研究主要集中在构建及医疗用途上，关于glp-2类似物药物生物学活性的检测方法的研究相对较少，基于此，本发明通过构建稳定表达glp-2受体的细胞，通过检测glp-2类似物药物刺激后报告基因表达的变化来对药物生物学活性进行定量。该方法具有操作简单，试验周期短、反应灵敏，变异性小，专属性强、准确性高的优点，可用于产品的放行检验，对于替度格鲁肽的质量控制和临床应用具有重要意义。

技术实现思路

1、为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种测定glp-2类似物药物生物学活性的细胞。

2、为了实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

3、本发明的第一方面提供一种测定glp-2类似物药物生物学活性的细胞株的构建方法。

4、进一步，所述方法包括如下步骤：

5、1)glp-2r基因的表达载体和cre-minip-报告基因的表达载体转染效应细胞；

6、2)筛选得到表达glp-2r和cre-minip-报告基因的单克隆细胞株；所述cre-minip是将cre基因与minip基因连接形成的完整基因组，所述cre基因的序列如seq id no.7所示，所述minip基因的序列如seq id no.8所示，所述cre-minip基因的序列如seq id no.9所示。

7、本领域技术人员可根据cre基因与minip基因序列选择不同的方法合成cre-minip基因，在本发明的具体实施例中，将cre基因与minip基因交至苏州东岭生物技术有限公司利用基因全合成技术进行连接。

8、进一步，步骤1)中所述的报告基因包括gus基因、nptii基因、cat基因、nos基因、luc基因、gfp基因。

9、进一步，所述报告基因为luc基因。

10、术语“报告基因”是一种编码在内源蛋白背景下易被检测出来的蛋白质或酶的基因。报告基因与目的基因或调控序列相连，通过间接或直接检测报告基因编码产物的信号，比如报告蛋白、mrna、酶等，直观反映细胞内基因的转录活性或表达水平。一般报告基因的特点是无毒、无免疫原性、易于检测、具有一定的特异性。

11、在本发明的具体实施例中，使用的报告基因为luc基因，即荧光素酶报告基因。荧光素酶(luciferase)来自于自然界能够发光的生物，是在生物体内能够催化荧光素(luciferin)或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。根据来源生物种类的不同，可将荧光素酶分为萤火虫荧光素酶(fl)和细菌荧光素酶(bl)。目前，以北美萤火虫来源的荧光素酶基因的应用最为广泛，该基因可编码产生550个氨基酸的荧光素酶蛋白。fl基因来自萤火虫，在mg2+、atp、o2的参与下，催化d-荧光素(d-luciferin)氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550-580nm的荧光。荧光素酶报告基因检测是现代分子生物学研究领域中分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具。荧光素酶报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物，来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)，然后通过化学发光仪或液闪测定仪测定。

12、进一步，步骤1)中所述的表达载体包括质粒载体、噬菌体载体、病毒载体。

13、进一步，所述表达载体为质粒载体。

14、术语“质粒”是一种独立于细胞核区dna外的裸露的双链环状dna分子，它具备自主复制的能力，并能在细胞中稳定遗传。质粒主要存在于细菌中，但也可以在真核生物中发现。在质粒上导入特定的dna序列，这些序列编码了某种或某些特定的蛋白质，从而赋予宿主细胞新的性状或功能。例如，质粒可以携带用于基因治疗的目的基因，或者用于蛋白质生产的编码序列，或者通过转染使细胞具有新的功能。在本发明中，本领域技术人员可以选择不同的质粒将glp-2r基因和cre-minip-报告基因导入细胞。

15、在本发明的具体实施例中，含有glp-2r基因的质粒为plu.cmv.zeo.glp2r-flag；含有cre-minip-荧光素酶报告基因的质粒为plu.cre.minip.luc.puro。

16、术语“转染”是指将外源dna(如质粒)导入真核细胞中的过程，使外源基因在细胞内表达。质粒转染是基因工程中的一项重要技术，广泛应用于基因功能研究、蛋白质生产等领域。

17、进一步，步骤1)中所述的效应细胞为hek293。

18、通常用于转染的细胞类型多样，包括但不限于以下几种：

19、1)原代细胞及其衍生物，这些细胞直接从生物体组织分离得到，未经长期体外培养，保持了较高的生理活性和分化潜能。

20、2)肿瘤细胞系：如人乳腺癌细胞(mcf-7)、人肺癌细胞(a549)、人宫颈癌细胞(hela)等，这些细胞系具有高分裂速度和稳定性，常用于基因功能研究和药物筛选。

21、3)特定组织来源的细胞系：

22、人胚肾细胞(hek-293)：具有高转染效率和稳定性，常用于基因克隆和疫苗生产。

23、人胚肺细胞(hel)：在某些实验中用作受体细胞。

24、人脐静脉内皮细胞(huvec)：用于研究血管生物学和心血管疾病等。

25、4)动物细胞系：

26、幼仓鼠肾细胞(bhk-21)：广泛用于病毒学研究和其他生物医学研究。

27、小鼠胚胎成纤维细胞(nih3t3)：具有低免疫原性和高分裂速度，常用于基因敲除和药物筛选。

28、其他特殊细胞类型：

29、神经元细胞：用于神经生物学研究。

30、大鼠肝细胞：用于药物代谢和毒性研究。

31、大鼠胶质瘤细胞(c6)：具有高分化度和稳定性，常用于药物筛选和肿瘤研究。

32、本领域技术人员可根据现有技术选择不同的效应细胞。在本发明的具体实施例中，效应细胞为hek293。

33、进一步，步骤1)中所述的转染方式包括物理介导、化学介导、生物介导。

34、优选地，所述转染方式为生物介导。

35、更优选地，所述转染方式为慢病毒感染。

36、细胞转染的方式包括物理介导、化学介导、生物介导。所述物理介导包括电穿孔法、显微注射法、基因枪法；所述化学介导包括磷酸钙共沉淀法、阳离子聚合物法、阳离子脂质体法；所述生物介导主要为病毒介导，如慢病毒、腺病毒等。在本发明的具体实施例中，所述转染方式为慢病毒转染。

37、进一步，步骤2)中所述的筛选包括如下步骤：加压筛选、单克隆分离培养、流式分析。

38、术语“加压筛选”是指通过特定的选择压力来实现对成功转染细胞的筛选和保留。通常，加压筛选方式包括抗生素筛选、基因表达产物筛选。

39、在本发明的具体实施例中，所述加压筛选是通过加入抗生素进行筛选。

40、在细胞筛选中，抗生素通常用作抗性筛选的工具，以区分成功转染的细胞与未转染的细胞。这些抗生素通过抑制未转染细胞的生长或杀死它们，从而允许成功转染并表达抗生素抗性基因的细胞存活下来。

41、进一步，所述抗生素包括但不限于：青霉素-链霉素混合物、g-418(geneticin，遗传霉素)、杀稻瘟菌素(blasticidin)、潮霉素(hygromycin b)、嘌呤霉素(puromycin)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、氨苄青霉素(ampicillin)、博来霉素(zeocin)。

42、优选地，所述抗生素为博来霉素和嘌呤霉素。

43、更优选地，所述博来霉素、嘌呤霉素的浓度分别为200μg·ml-1、3μg·ml-1。

44、本发明的第二方面提供一种测定glp-2类似物药物生物学活性的细胞。

45、进一步，所述细胞命名为glp2r-gre-luc-293，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.46046，分类命名为human hek293细胞，保藏日期为2024年09月03日。

46、进一步，所述细胞是通过本发明第一方面所述的构建方法构建得到的。

47、在本发明的具体实施例中，所述d9细胞表达glp2r的阳性率最高，达到97.4％，同时对glp-2类似物药物替度格鲁肽的响应能力最强，使用此细胞测定glp-2类似物药物生物学活性效果更好，因此，将此细胞进行保藏，命名为glp2r-gre-luc-293，于2024年09月03日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

48、本发明的第三方面提供一种快速测定glp-2类似物药物生物学活性的方法。

49、进一步，所述方法包括如下步骤：将glp-2类似物加入本发明第二方面所述的细胞中，进行孵育，根据测定的报告基因信号值确定glp-2类似物药物的生物学活性。

50、在本发明中，测定报告基因信号值后拟合四参数曲线来确定glp-2类似物药物的生物学活性。术语拟合四参数曲线是一种数学方法，用于通过拟合一条曲线来描述一组数据，并获取能描述数据关系的函数方程，以便对未来的数据进行预测。四参数曲线通常由四个参数定义，这些参数在生物学背景下具有实际意义。例如，在检测药物生物学活性中，这四个参数可能代表：吸光度下限值(d)，吸光度上限值(a)，即吸光度的最小值和最大值；半数反应浓度(c)，即药物浓度达到一半最大反应时的值；以及曲线的斜率(b)。通过这些参数，可以更准确地理解和分析实验数据，从而为生物学研究提供更深入的见解。

51、进一步，所述glp-2类似物药物的作用浓度范围为10×10-7-10×10-5μg·ml-1。

52、进一步，所述glp-2类似物包括替度格鲁肽，其氨基酸序列为h-his-gly-asp-gly-ser-phe-ser-asp-glu-met-asn-thr-ile-leu-asp-asn-leu-ala-ala-arg-asp-phe-ile-asn-trp-leu-ile-gln-thr-lys-ile-thr-asp-oh。

53、进一步，所述glp-2类似物包括艾西糖肽，其氨基酸序列为his-gly-glu-gly-ser-phe-ser-ser-glu-leu-ser-thr-ile-leu-asp-ala-leu-ala-ala-ar g-asp-phe-ile-asn-trp-leu-ile-ala-thr-lys-ile-thr-asp-lys-lys-lys-lys-lys-lys。

54、进一步，所述glp-2类似物包括阿帕拉格鲁肽，其氨基酸序列为his-gly-asp-gly-ser-phe-ser-asp-glu-nle-{d-phe}-thr-ile-leu-asp-leu-leu-ala-ala-arg-asp-phe-ile-asn-trp-leu-ile-gln-thr-lys-ile-thr-asp-nh2。

55、进一步，所述glp-2类似物还包括glepaglutide，其氨基酸序列为his-gly-glu-gly-thr-phe-ser-ser-glu-leu-ala-thr-ile-leu-asp-ala-leu-ala-ala-arg-asp-phe-ile-asn-trp-leu-ile-ala-thr-lys-ile-thr-asp-lys-lys-lys-lys-lys-lys-nh2。

56、术语“glp-2类似物”是一类与胰高血糖素样肽-2(glp-2)结构相似，但可能经过某些修饰以改善其生物活性或稳定性的化合物，glp-2类似物通常保留或增强了glp-2的某些关键生物功能，如促进肠道吸收、改善肠道健康等。由于glp-2在肠道健康中的重要作用，glp-2类似物在治疗与肠道功能相关的疾病方面具有广泛的应用前景。

57、本发明所述的替度格鲁肽(teduglutide)是一种胰高血糖素样肽-2(glp-2)类似物，于2024年2月23日获得中国国家药品监督管理局(nmpa)批准，用于治疗短肠综合征(sbs)的成人和1岁及以上儿童患者。它是中国首个治疗短肠综合征的glp-2类似物，有助于增加肠道吸收面积，减少患者对肠外营养的依赖，改善生活质量。其分子式为c170h259n47o56s1，平均分子量(mw)为3889.2728g/mol，其序列中含有33个氨基酸，如seq idno.1所示，其中x为h，z为oh。

58、本发明所述的艾西糖肽(elsiglutide)是一种glp-2类似物和具有口服活性和选择性的glp-2受体激动剂，能够增加细胞增殖，减少肠道细胞凋亡。其序列中含有39个氨基酸，如seq id no.2所示，其可改善由lapatinib(hy-50898)诱导的大鼠腹泻症状。其分子式为c197h323n53o58，平均分子量(mw)为4362.0519g/mol。

59、本发明所述的阿帕拉格鲁肽(apraglutide)是一种合成的33-氨基酸肽和长效的glp-2类似物，能够增强全回肠切除的新生短肠综合征小猪的适应性和线性肠生长。其分子式为c172h263n43o52，平均分子量(mw)为3765.2371g/mol，序列如seq id no.3所示，其中x为nle，z为nh2，第11位的f为d-phe。

60、本发明所述的glepaglutide是一种长效的glp-2类似物，也是一种有效的glp-2r激动剂。它可减少粪便排出量并增加肠道吸收，同时具有减轻小肠炎症的潜力。glepaglutide主要用于炎症性肠病(ibd)和克罗恩病的研究，也被开发作为短肠综合征(sbs)的潜在治疗选择。其序列中含有39个氨基酸，如seq id no.4所示，其中z为nh2，其分子式为c198h326n54o56，平均分子量(mw)为4359.0946g/mol。

61、在本发明的具体实施例中，glp-2类似物替度格鲁肽药物的初始浓度为10μg·ml-1，分别进行5、6和7倍梯度稀释后进行检测。

62、优选地，替度格鲁肽的最佳稀释倍数为7倍。

63、进一步，所述细胞的接种密度为8×105-1×106cells·ml-1。

64、进一步，所述孵育的时间为4-6h。

65、优选地，所述孵育的时间选取5h。

66、本发明的第四方面提供一种快速测定glp-2类似物药物生物学活性的产品。

67、进一步，所述产品包括本发明第二方面所述的细胞。

68、进一步，所述产品类型包括试剂盒。

69、在本发明中，试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

70、本发明的第五方面提供一种用于glp-2类似物药物活性评价的体系。

71、进一步，所述体系包括如下组分：本发明第二方面所述的细胞、glp-2类似物药物样品及参比品。

72、在本发明中，术语“体系”是指药品质量控制体系，是指通过科学的管理方法，对药品生产过程中的各种因素进行控制，以保证药品质量符合预定的质量标准和要求。

73、本发明的第六方面提供如下任一方面的应用。

74、进一步，所述应用包括：

75、1)本发明第二方面所述的细胞在制备检测glp-2类似物药物生物学活性的产品中的应用；

76、2)本发明第五方面所述的体系在glp-2类似物药物的质量控制中的应用。

77、本文中使用的术语“样品”，是指待鉴别、待测定的供测试样品。在本发明中，glp-2类似物药物样品包括在工业生产中被生产出的待检测其生物学活性的药物样品。

78、在本发明中，除非另有说明，否则术语“包含”、“包括”和“含有”为开放式表达，意味着除所列出的要素、组分和步骤外，还可涵盖其它未指明的要素、组分和步骤。

79、除非另有定义，本发明上下文中的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。

80、本发明的优点和有益效果如下：本发明提供了一种快速测定glp-2类似物药物生物学活性的细胞，并提供了此细胞株在检测glp-2类似物药物生物学活性的方法，该方法具有操作简单，试验周期短、反应灵敏，变异性小，专属性强、准确性高的优点，可用于产品的放行检验，对于替度格鲁肽的质量控制和临床应用具有重要意义。

技术特征：

1.一种测定glp-2类似物药物生物学活性的细胞株的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的报告基因包括gus基因、nptii基因、cat基因、nos基因、luc基因、gfp基因；

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的筛选包括如下步骤：加压筛选、单克隆分离培养、流式分析；

4.一种测定glp-2类似物药物生物学活性的细胞，其特征在于，所述细胞命名为glp2r-gre-luc-293，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.46046，分类命名为human hek293细胞，保藏日期为2024年09月03日。

5.一种快速测定glp-2类似物药物生物学活性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将glp-2类似物加入权利要求4所述的细胞中，进行孵育，根据测定的报告基因信号值确定glp-2类似物药物的生物学活性。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述glp-2类似物药物的作用浓度范围为10×10-7-10×10-5μg·ml-1；

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞的接种密度为8×105-1×106cells·ml-1；

8.一种快速测定glp-2类似物药物生物学活性的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求4所述的细胞。

9.一种用于glp-2类似物药物活性评价的体系，其特征在于，所述体系包括如下组分：权利要求4所述的细胞、glp-2类似物药物样品及参比品。

10.如下任一方面的应用，其特征在于，所述应用包括：

技术总结
本发明公开了一种测定GLP‑2类似物药物生物学活性的细胞，并提供了使用此细胞测定GLP‑2类似物药物生物学活性的方法，所述方法包括将GLP‑2类似物加入本发明提供的细胞中，进行孵育，根据测定的报告基因信号值确定GLP‑2类似物药物的生物学活性。所述方法操作简单，试验周期短、反应灵敏，变异性小、专属性强、准确性高。

技术研发人员：张孝明,李晶,梁成罡,吕萍
受保护的技术使用者：中国食品药品检定研究院（国家药品监督管理局医疗器械标准管理中心、中国药品检验总所）
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5