烟草CBL家族基因NtCBL3在提升烟叶钾含量中的应用的制作方法

本发明涉及基因，更具体地，本发明涉及烟草cbl家族基因ntcbl3a在提高烟叶钾含量中的应用。

背景技术：

1、钾(k+)是植物中最重要的矿质营养元素，参与了细胞中蛋白合成、细胞运动和渗透调节等生理功能。烟草(nicotiana tabacum)作为一种高度依赖钾素的经济作物，烟叶是最主要的应用器官，烟草中钾素含量直接影响烟草烟叶的外观质量、化学成分以及燃烧性等多种品质标准。提高烟草中的钾含量，能够使烟叶呈深桔黄色，叶片长宽、富有弹性和韧性并具有光泽，提升烟草品质和经济价值。然而目前，不仅面临钾肥产量短缺的问题，还面临着土壤中速效钾素的流失、土壤钾素含量不均衡等问题。如安顺烟区半数地区土壤中的速效钾含量低于150mg/kg的平均值，整体属于缺钾状态；吉安永丰县烟区土壤速效钾均值为123.90mg/kg，27.78％的土壤样品的速效钾处于极缺水平。然而，通过施用钾肥等措施提高烟叶钾含量，效果有限且可能导致土壤板结等副作用。因此，利用基因工程培育富含钾素的优质新品种，这对烟草品种改良工作具有一定的意义。

2、钙离子(ca2+)作为重要的次级信号分子参与植物的生长发育及环境信号的应答。其中，类钙调磷酸酶b亚基蛋白(calcineurinb-like protein，cbl)家族是植物中特异存在的钙离子感受器家族。该家族成员cbl2和cbl3会与下游互作蛋白激酶cipk(cbl-interactingproteinkinase)中的cipk3/9/23/26形成复合体，参与了液泡中k+的释放并调控植物中k+的动态平衡。

3、本发明从普通烟草中克隆到一个来源于父本祖先种林烟草中的cbl家族基因ntcbl3a，并利用基因编辑技术构建烟草ntcbl3a敲除材料。通过功能分析，明确敲除ntcbl3a可提高烟叶钾含量，鉴定负调控烟草钾含量提高的相关基因ntcbl3a并加以应用，在提高烟叶钾含量中具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的问题，本发明提出一个烟草cbl家族基因ntcbl3a在烟草中的新应用，通过鉴定获得了该烟草cbl家族基因ntcbl3a具有促进烟草烟叶钾素积累的新功能，拓展了该基因在烟草钾素积累效率改良中的新用途。

2、本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

3、本发明提供一种烟草cbl家族基因ntcbl在提升烟草钾含量中的应用，所述基因的核苷酸序列包含如下(1)～(4)中的任一项：

4、(1)如seq id no.1所示的核苷酸序列；或，

5、(2)与seq id no.1所示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或，

6、(3)在seq id no.1所示的核苷酸序列中添加、取代、缺失或修饰1个或多个碱基，并且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或，

7、(4)在严格条件下与seq id no.1所示序列杂交的核苷酸序列。

8、优选地，所述ntcbl3a基因编码蛋白的氨基酸序列包含如下(5)～(7)中的任一项：

9、(5)如seq id no.2所示的氨基酸序列；或，

10、(6)与seq id no.2所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或，

11、(7)在seq id no.2所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或修饰1个或多个氨基酸残基，并且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。

12、本发明还提供一种包含所述的ntcbl3a基因的生物材料，所述生物材料为重组表达载体、表达盒或重组菌。

13、本发明还提供上述生物材料提高钾素能力的转基因植物中的应用。

14、优选地，所述提高钾素能力为影响烟草转基因植物中钾素积累的能力，进一步为提高烟草钾素的积累。

15、优选地，所述转基因植物为烟草烟叶。

16、本发明还提供一种培育提高钾素积累能力的转基因植物的方法，通过将上述包含ntcbl3a基因的重组表达载体导入受体植物中得到转基因植物，或通过crispr/cas9介导的基因编辑技术，构建用于敲除上述ntcbl3a基因的crispr/cas9基因编辑载体，经遗传转化获得ntcbl3a基因发生编辑的转基因植物。

17、优选地，所述重组表达载体中包含的启动子为35s启动子，所述重组表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体；所述重组表达载体包含外源基因的3′端非翻译区域。

18、优选的，所述重组表达载体中包含可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶基因或发光化合物的基因或具有抗性的抗生素标记物基因或抗化学试剂标记基因。

19、优选地，所述重组表达载体具体为pcambia-1300-221、pgreen0029、pcambia3301、pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia1301-ubin、pore-cas9、pylcrispr/cas9-mt、pcas9grna7、pcas9grna7-gfp或其它衍生植物表达载体。

20、使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，优选花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛素基因ubiquitin启动子(pubi)、胁迫诱导型启动子rd29a等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。

21、此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。

22、翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

23、更为具体的，所述重组表达载体为pdc45-cas9/grna-ntcbl3a基因敲除载体。

24、本发明还提供一种烟草品种，所述烟草品种采用上述方法培育得到的。

25、本发明有益效果是：

26、本发明的烟草cbl家族基因ntcbl3a是烟叶钾含量积累的负调控因子。

27、本发明通过调节基因ntcbl3a表达水平控制烟草烟叶的钾素积累，通过基因工程手段获得ntcbl3a基因的转基因作物，该技术符合现代农业发展需求，对于增加烟草的新功能利用和研究烟草钾素积累、培育高钾烟草品种方面具有重要的实用价值和市场前景，敲除ntcbl3a基因能够提高烟草植株钾素的积累。

技术特征：

1.烟草cbl家族基因ntcbl3a在提高烟草钾含量中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列包含如下(1)～(4)中的任一项：

2.如权利要求1所述烟草cbl家族基因ntcbl3a在提高烟草钾含量中的应用，其特征在于，所述ntcbl3a基因编码蛋白的氨基酸序列分别包含如下(5)～(7)中的任一项：

3.一种包含权利要求1或2所述的ntcbl3a基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组表达载体、表达盒或重组菌。

4.根据权利要求1所述的ntcbl3a基因或根据权利要求3所述的生物材料在转基因植物中提高钾素能力的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述ntcbl3a基因能够提高烟叶钾含量。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述转基因植物为烟草烟叶。

7.一种培育提高钾素积累能力的转基因植物的方法，其特征在于，通过将包含权利要求1所述的ntcbl3a基因的重组表达载体导入受体植物中得到转基因植物，或通过crispr/cas9介导的基因编辑技术，构建用于敲除权利要求1所述的ntcbl3a基因的crispr/cas9基因编辑载体，经遗传转化获得ntcbl3a基因发生编辑的转基因植物。

8.根据权利要求7所述的培育提高钾素积累能力的转基因植物的方法，其特征在于，所述重组表达载体中包含的启动子为35s启动子。

9.根据权利要求7或8所述的培育提高钾素积累能力的转基因植物的方法，其特征在于：所述重组表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体。

10.根据权利要求7或8所述的培育提高钾素积累能力的转基因植物的方法，其特征在于：所述重组表达载体包含外源基因的3’端非翻译区域。

技术总结
本发明公开了一种烟草CBL家族基因NtCBL3A在提高烟草钾含量中的应用烟草，所述基因NtCBL3A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，通过转基因技术培育提高钾素积累能力的转基因烟草植物，提高烟草钾素积累能力、培育高钾烟草。

技术研发人员：徐刚,宁扬,薛琳,农童嘉,崔萌萌,石楚含,邓帅军,王倩,戴培刚
受保护的技术使用者：安徽皖南烟叶有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5