CaMKII结合域自组装蛋白质纳米颗粒及其制备和应用
本发明涉及一种蛋白质纳米颗粒及其制备和应用，尤其涉及camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒及其制备和应用。
背景技术：
1、抗肿瘤免疫治疗一般涉及巨噬细胞和树突状细胞的激活。巨噬细胞为吞噬细胞，在脊椎动物体内参与非特异性防卫(先天性免疫)和特异性防卫(细胞免疫)。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行吞噬和消化，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体做出反应。巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。一般认为，巨噬细胞受不同的环境影响刺激成m1表型和m2表型。在肿瘤微环境中，巨噬细胞大多表现为免疫抑制性的m2表型。在激动剂或免疫佐剂的刺激下，肿瘤微环境中巨噬细胞有望极化成有利于肿瘤治疗的m1表型，释放炎症细胞因子，增强抗原提呈能力和吞噬能力，从而遏制肿瘤生长。树突状细胞(dendriticcells,dc)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟的dc具有较强的迁移能力，成熟的dc能有效激活初始t细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。人体内大部分dc处于非成熟状态，表达低水平的共刺激因子和粘附因子，体外激发同种混合淋巴细胞增殖反应的能力较低，但未成熟dc具有极强的抗原吞噬能力，在摄取抗原(包括体外加工)或受到某些因素刺激时即分化为成熟dc，而成熟的dc表达高水平的共刺激因子和粘附因子。dc在成熟的过程中，由接触抗原的外周组织迁移进入次级淋巴器官，与t细胞接触并激发免疫应答。
2、免疫佐剂简称佐剂，即非特异性免疫增生剂，指那些同抗原一起或预先注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。免疫佐剂的开发在抗病毒疫苗和肿瘤免疫治疗领域有着极其重要的意义。病毒疫苗佐剂是指预先或与病毒抗原同时注入机体，可增强机体对病毒抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强物质，可增强机体对抗原的免疫应答，同时具有如局部炎症反应、免疫原性不强、半衰期较短、靶向性弱、吸收慢、储存和运送要求高等缺点。主流的肿瘤治疗方法，如化疗和放疗产生的毒副作用较大，基于免疫检查点抑制剂的免疫疗法也承受着免疫耐受的制约，而免疫佐剂可以与多种疗法联用，可提高化疗、放疗和免疫治疗的效果，增强机体免疫应答，延长癌症患者的生存时间。目前用于肿瘤免疫治疗的免疫佐剂屈指可数，急需开发毒性低、免疫增强效果强的抗肿瘤免疫佐剂。
3、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(camkii)包括四个结构域：酶催化结构域，抑制结构域，ca2+/cam(camodulin，钙调蛋白)结构域和结合域。现有的研究主要集中于camkii全蛋白的生物功能，camkii的独立结构域的生物功能研究，尤其是camkii的某个独立结构域对抗肿瘤免疫的影响尚未见报道。
技术实现思路
1、发明目的：本发明的目的是提供一种camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒，解决如何特异性增强免疫反应的问题。本发明的另一目的在于提出camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒的制备方法，解决如何制备camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒的问题。本发明的第三目的在于提出camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒在制备增强肿瘤免疫治疗的佐剂或抗肿瘤药物中的应用，解决如何提升抗肿瘤药效的问题。
2、技术方案：本发明所述的camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒，所述蛋白质纳米颗粒由重组蛋白单体在缓冲液中自组装形成，所述重组蛋白单体的氨基酸序列至少包含seq id no.1所示序列。
3、优选地，所述重组蛋白单体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、优选地，所述蛋白质纳米颗粒为重组蛋白单体的2-12聚体，所述缓冲液为中性tris缓冲液，更具体地，为ph＝7.5～8.5的tris缓冲液。
5、为了获得上述camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒，本发明提供一种该蛋白质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
6、(1)构建含有重组蛋白单体基因的表达载体；
7、(2)将表达载体转化进入工程菌构建重组菌；
8、(3)培养重组菌，表达重组蛋白单体；
9、(4)培养结束后收集菌体，将菌体破碎后进行蛋白纯化得到蛋白质纳米颗粒。
10、优选地，在步骤(1)中，所述重组蛋白单体基因序列如seq id no.2所示；所述表达载体为重组质粒，在一些实施例中，空白质粒选择pet-29b(+)，重组蛋白单体基因插入空白质粒的多克隆位点为ndel/xhol。重组蛋白单体基因序列可以seq id no.2为目的序列设计pcr引物，根据常规pcr反应得到重组蛋白单体基因。
11、优选地，在步骤(2)中，所述转化的方法为：将表达载体溶液与工程菌悬液混合后冰水浴2-8min，再于41-43℃处理25-35s后，冰水浴1.5-2.5min，再将菌液涂布于含有抗生素的固体培养基表面，培养后挑取阳性单菌落即为重组菌。本发明中的工程菌可以是大肠杆菌，如bl-21，也可以是酵母菌、乳酸菌或枯草芽孢杆菌等。抗生素可以是卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素等，具体抗生素的种类可根据表达载体的抗性基因选择。
12、优选地，在步骤(3)中，所述培养重组菌的方法为：将重组菌接种于lb液体培养基中，37℃摇菌培养12-26h，期间，在2-6h时进行诱导表达。
13、优选地，在步骤(4)中，所述将菌体破碎后进行蛋白纯化的方法为：重悬菌体后破碎菌体，离心收集上清液，采用镍柱和层析柱纯化上清液，其中，重悬菌体和层析柱纯化均采用中性tris缓冲液。
14、所述破碎菌体可采用超声破碎，超声破碎的条件为超声波破碎仪，超声功率为80％，超声10s间隔10s，总超声时间为5min。
15、所述蛋白纯化方法也可以选择亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤等。
16、所述层析柱纯化的条件为：层析柱选择superdextm 200increase 10/300gl，流速为0.6ml/min，收集柱体积12ml左右最高峰收集标。
17、在一些实施例中，菌体破碎和蛋白纯化过程中采用的tris缓冲液为20mm tris[ph8.0]，100mm nacl的溶液。
18、本发明进一步将上述camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒应用于制备增强肿瘤免疫治疗的佐剂或抗肿瘤药物。本发明可以选择性增强巨噬细胞和树突状细胞增殖能力，促进巨噬细胞极化成利于肿瘤治疗的m1表型，并且可以促进树突状细胞成熟，进而呈递抗原，激活t细胞，从而达到抗肿瘤作用。
19、优选地，所述肿瘤包括黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、脑癌、血癌、淋巴癌、胆管癌中的一种或多种。
20、所述抗肿瘤药物包含camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括赋形剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等，所述抗肿瘤药物的剂型包括颗粒剂、胶囊、片剂、注射液、输液剂、栓剂等。
21、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：1、本发明可以选择性促进巨噬细胞和树突状细胞增殖，而不能促进成纤维细胞和黑色素瘤细胞增殖，同时促进巨噬细胞向m1表型极化并增强其抗原提呈能力，促进巨噬细胞释放大量炎症细胞因子tnf-α和il-6，并且能够促进树突状细胞成熟，成功实现了增强肿瘤免疫治疗的目的；2、本发明提供具有良好应用前景的一类的佐剂，能够应用于疫苗增效，增强肿瘤免疫治疗效果，提升现有抗肿瘤方法的药效。
技术特征：
1.camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白质纳米颗粒由重组蛋白单体在缓冲液中自组装形成，所述重组蛋白单体的氨基酸序列至少包含seq id no.1所示序列。
2.根据权利要求1所述camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒，其特征在于，所述重组蛋白单体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求1所述camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白质纳米颗粒为重组蛋白单体的2-12聚体，所述缓冲液为中性tris缓冲液。
4.根据权利要求1-3任一项所述camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述重组蛋白单体基因序列如seq id no.2所示；所述表达载体为重组质粒。
6.根据权利要求4所述camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述转化的方法为：将表达载体溶液与工程菌悬液混合后冰水浴2-8min，再于41-43℃处理25-35s后，冰水浴1.5-2.5min，再将菌液涂布于含有抗生素的固体培养基表面，培养后挑取阳性单菌落即为重组菌。
7.根据权利要求4所述camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述培养重组菌的方法为：将重组菌接种于lb液体培养基中，37℃摇菌培养12-26h，期间，在2-6h时进行诱导表达。
8.根据权利要求4所述camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述将菌体破碎后进行蛋白纯化的方法为：重悬菌体后破碎菌体，离心收集上清液，采用镍柱和层析柱纯化上清液，其中，重悬菌体和层析柱纯化均采用中性tris缓冲液。
9.根据权利要求1-3任一项所述camkii结合域自组装蛋白质纳米颗粒在制备增强肿瘤免疫治疗的佐剂或抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、脑癌、血癌、淋巴癌、胆管癌中的一种或多种。
技术总结
本发明公开了CaMKII结合域自组装蛋白质纳米颗粒及其制备和应用。CaMKII结合域自组装蛋白质纳米颗粒由重组蛋白单体在缓冲液中自组装形成，所述重组蛋白单体的氨基酸序列至少包含SEQ ID NO.1所示序列。重组蛋白单体通过分子生物学手段重组表达获得。本发明可以选择性促进巨噬细胞和树突状细胞增殖，无法促进成纤维细胞和肿瘤细胞增殖，同时促进巨噬细胞向M1表型极化并增强其抗原提呈能力，同时释放大量炎症细胞因子TNF‑α和IL‑6，以及促进树突状细胞成熟增强其抗原提呈能力。本发明提供一类具有良好应用前景的佐剂，能够应用于疫苗增效及配合现有抗肿瘤药物的免疫治疗，有效提升现有抗肿瘤疗法的药效。
技术研发人员：翁丽星,许妙苗,卫思源,汪联辉
受保护的技术使用者：南京邮电大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5