靶向CYP3A5在胶质瘤治疗中的作用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及靶向cyp3a5在胶质瘤治疗中的作用。

背景技术：

1、胶质母细胞瘤(glioblastoma,gbm)是最常见、最致命的恶性脑肿瘤。即使实施了包括手术、放疗和化疗在内的标准治疗，但目前新诊断的gbm的中位总生存期仍较短，为15-17个月。胶质母细胞瘤干细胞(gscs)促进肿瘤表型可塑性和异质性，是肿瘤发生、发展和治疗耐药的原因。gscs通过notch和受体酪氨酸激酶等分子信号通路维持自我更新，后者是激活pi3k-akt或stat信号级联的生长因子受体。替莫唑胺(tmz)治疗会产生进化选择压力，导致耐药gscs增殖，其特征是dna修复能力增强。然而，gscs维持自我更新和促进化学耐药的机制仍未得到充分阐明。

2、cyp3a5是细胞色素p450(cyp)酶超家族的成员，参与药物代谢和脂质合成。p450作为单加氧酶，利用还原性nad(nadh)或还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)作为电子供体(nad(p)h+o2+r→nad(p)++ro+h2o)。cyp3a5在肿瘤中的作用是有背景的。据报道，cyp3a5通过mtorc2/akt信号通路在肝细胞癌中发挥抑癌作用。另一方面，cyp3a5被认为介导胰腺导管腺癌的治疗耐药。尽管如此，cyp3a5在gbm进展中的作用尚不清楚。

技术实现思路

1、为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与胶质母细胞瘤相关的生物标志物cyp3a5，其可用于胶质母细胞瘤的诊断、预后判断、预防和/或治疗。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面提供一种胶质母细胞瘤相关生物标志物。

4、进一步，所述生物标志物为cyp3a5。

5、进一步，所述生物标志物可用于胶质母细胞瘤的诊断、预后判断、预防和/或治疗。

6、进一步，所述生物标志物cyp3a5在胶质母细胞瘤中的表达水平显著升高。

7、在本发明中，术语“生物标志物”是指以可用于预测个体的癌症状态的不同浓度存在于个体中的生物分子。生物标志物可包括，但不限于，核酸、蛋白质及其变体和片段。生物标志物可以是包含编码该生物标志物的全部或部分核酸序列或这类序列的互补体的dna。可用于本发明的生物标志物核酸被认为包括包含任何目的核酸序列的全部或部分序列的dna和rna。

8、在本发明的具体实施方式中，所述生物标志物包括基因及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的生物标志物，以及源自细胞中加工的任何形式的生物标志物。该术语涵盖生物标志物的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。

9、本发明的第二方面提供一种用于早期诊断或预测胶质母细胞瘤预后的产品。

10、进一步，所述产品包括检测本发明第一方面所述的生物标志物cyp3a5表达水平的试剂。

11、进一步，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸、高通量测序平台。

12、进一步，所述检测样本中生物标志物cyp3a5表达水平的试剂包括检测样本中生物标志物cyp3a5 mrna表达水平的试剂、和/或检测样本中生物标志物cyp3a5编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂。

13、进一步，所述检测样本中生物标志物cyp3a5 mrna表达水平的试剂包括特异性识别生物标志物cyp3a5的探针、和/或特异性扩增生物标志物cyp3a5的引物。

14、进一步，所述检测样本中生物标志物cyp3a5编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂包括特异性结合生物标志物cyp3a5的抗体、和/或抗体片段、和/或亲和性蛋白。

15、在本发明中，芯片包括基因芯片和/或蛋白芯片，所述基因芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于cyp3a5所示的部分或全部序列；所述蛋白芯片包括：固相载体；以及有序固定在固相载体上的抗体或配体，所述抗体或配体能够特异性的结合cyp3a5蛋白。

16、具体地，可根据本发明所述的基因，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

17、“探针”意欲包括在促进杂交的条件下与核酸或其补体中的靶标序列特异性杂交，从而允许检测靶标序列或其扩增的核酸的核酸寡聚体或适体。检测可以是直接(即由直接与靶标或扩增的序列杂交的探针产生)或间接(即由与连接探针和靶标或扩增的序列的中间分子结构杂交的探针产生)的。探针的“靶标”通常指扩增的核酸序列中与至少部分探针序列通过标准氢键或“碱基配对”特异性杂交的序列。探针可被标记或不标记。探针可通过具体dna序列的分子克隆生产，也可被合成。本发明所属领域的技术人员可容易地确定可在本发明的背景下设计和使用的多种引物和探针。

18、在本发明中，所述试剂盒可用于检测cyp3a5基因或蛋白的表达。优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记rna样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取rna、pcr、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

19、试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

20、在本发明中，术语“样本”以其最广泛的含义使用。意欲包括任何源自活或死亡的人的组织或材料，其可包括本发明的标志物。在本发明的具体实施例中，样品可以是肿瘤或胶质瘤组织。

21、本发明的第三方面提供一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物。

22、进一步，所述药物组合物包括靶向本发明第一方面所述生物标志物cyp3a5的抑制剂。

23、进一步，所述抑制剂是指任何可降低编码cyp3a5核酸的表达、降低cyp3a5蛋白质水平，或抑制cyp3a5活性的物质，优选为降低cyp3a5蛋白的活性、降低cyp3a5基因或蛋白的稳定性、下调cyp3a5的表达、减少cyp3a5蛋白有效作用时间、或抑制cyp3a5的转录和翻译的物质。

24、优选地，所述抑制剂包括cobicistat。

25、优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

26、优选地，所述药物组合物为替莫唑胺(tmz)和cobicistat。

27、更优选地，所述cobicistat和tmz的配比为2:1。

28、在本发明中，所述抑制剂包括但不限于：核酸抑制物、蛋白抑制剂、蛋白水解酶、蛋白结合分子；及其组合。其中核酸抑制物选自：以cyp3a5或其转录本为靶序列、且能够抑制cyp3a5基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna的构建物。蛋白结合分子选自：与cyp3a5蛋白特异性结合的物质，如能够抑制cyp3a5蛋白活性的抗体或配体；cyp3a5配体结合位点的竞争剂，包括cyp3a5受体与其配体结合片段、可溶性截短的cyp3a5受体、可溶性cyp3a5受体融合蛋白，例如包含igg免疫球蛋白的fc部分的cyp3a5融合蛋白、配体融合蛋白；拟肽；肽抑制剂；小分子化合物；及其组合。

29、在本发明中，所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞(宿主细胞)转染试剂。

30、本发明可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：口服给药、皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是口服给药。

31、优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将cyp3a5的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带cyp3a5的抑制剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或sirna或shrna)递送到靶点上，并使之表达活性的cyp3a5抑制剂，具体情况需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

32、本发明的药物组合物还可与其他治疗胶质母细胞瘤的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

33、本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

34、本发明第四方面提供一种应用。

35、进一步，所述应用包括以下任一种：

36、1)检测样本中本发明第一方面所述生物标志物cyp3a5表达水平的试剂在制备用于胶质母细胞瘤的早期诊断或预后判断的产品中的应用；

37、2)本发明第三方面所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗胶质母细胞瘤产品中的应用；

38、3)检测样本中本发明第一方面所述生物标志物cyp3a5表达水平的试剂在制备用于评价和/或预测胶质母细胞瘤患者对tmz敏感性的产品中的应用，优选地，在接受tmz治疗的无应答胶质母细胞瘤患者中，其cyp3a5表达水平显著高于接受tmz治疗的应答患者；

39、4)靶向本发明第一方面所述生物标志物cyp3a5的抑制剂在制备胶质母细胞瘤患者对tmz增敏的药物中的应用。

40、进一步，所述检测样本中生物标志物cyp3a5表达水平的试剂包括检测样本中生物标志物cyp3a5 mrna表达水平的试剂、和/或检测样本中生物标志物cyp3a5编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂。

41、进一步，所述检测样本中生物标志物cyp3a5 mrna表达水平的试剂包括特异性识别生物标志物cyp3a5的探针、和/或特异性扩增生物标志物cyp3a5的引物。

42、进一步，所述检测样本中生物标志物cyp3a5编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂包括特异性结合生物标志物cyp3a5的抗体、和/或抗体片段、和/或亲和性蛋白。

43、进一步，所述样本包括组织、体液。

44、进一步，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸、微阵列。

45、在某些实施方案中，如本文所用的测定“蛋白表达水平”、“基因表达”或“基因表达水平”包括但不限于测定相应的rna、蛋白或者肽水平(或其组合)。本发明不限于测定蛋白、肽或rna水平的具体方法和试剂，所有这些方法和试剂是本领域熟知的。

46、在本发明中，可用于检测cyp3a5表达水平试剂是本领域众所周知的。适用于本发明的这种试剂可市购获得或通过本领域技术人员熟知的方法常规地制得。

47、在本发明中，微阵列是指具有平坦表面的固相支持体，其具有核酸阵列，阵列中的各个成员包含固定在空间上确定的区域或位点上的寡核苷酸或多核苷酸的相同的拷贝，所述区域或位点不与阵列中的其它成员的区域或位点重叠；也就是说，所述区域或位点在空间上是离散的。此外，空间上确定的杂交位点可为“可寻址的”，因为其位置及其固定化的寡核苷酸的身份是已知或预先确定的(例如在其使用前是已知或预先确定的)。通常寡核苷酸或多核苷酸为单链，并通常由5'-端或3'-端与固相支持体共价连接。微阵列中含有非重叠区的核酸的密度通常大于100/cm2，更优选大于1000/cm2。

48、在本发明中，术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文可互换使用，是指温血动物，例如哺乳动物。该术语包括但不限于家畜、啮齿动物(例如大鼠和小鼠)、灵长类动物和人。优选该术语是指人。

49、本发明第五方面提供一种调节胶质母细胞瘤细胞中cyp3a5表达水平的方法。

50、进一步，所述方法包括如下步骤：将抑制stat3表达或活性、或促进stat3磷酸化的物质导入胶质母细胞瘤中。

51、进一步，当将抑制stat3表达或活性的物质导入胶质母细胞瘤中时，cyp3a5表达水平降低；当将促进stat3磷酸化的物质导入胶质母细胞瘤时，cyp3a5表达水平升高。

52、在本发明中，术语“stat3”是位于17号染色体的基因，编码的蛋白质是stat蛋白质家族的成员，在细胞的增殖、存活、分化、血管生成、免疫调节等多种生物学过程中发挥重要作用。stat3蛋白由约770个氨基酸组成，具有6个功能保守结构域，分别是氨基末端结构域、螺旋卷曲结构域、dna结合结构域、连接结构域、src同源2结构域和羧基末端反式激活结构域。

53、在本发明的具体实施例中，我们发现在胶质母细胞瘤中，stat3能够调控cyp3a5的表达，具体地，敲除stat3后，cyp3a5表达水平会下降，而激活stat3或促进stat3磷酸化后，cyp3a5表达水平升高。

54、本发明第六方面提供一种抑制胶质母细胞瘤细胞增殖的方法。

55、进一步，所述方法包括如下步骤：将本发明第一方面所述的生物标志物cyp3a5的抑制剂导入到胶质母细胞瘤细胞中，任选地，所述抑制剂包括抑制stat3表达或活性的物质。

56、在本发明的上下文中，所使用的术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”，是指包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

57、本发明的优点和有益效果：

58、本发明提供的生物标志物cyp3a5是胶质母细胞瘤的一个潜在治疗靶点，其在胶质母细胞瘤的诊断、预后、治疗及化疗耐药中具有重要作用，能够帮助临床医生对胶质瘤患者进行有效治疗，具有重要的临床应用价值。

技术特征：

1.一种胶质母细胞瘤相关生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为cyp3a5；

2.一种用于早期诊断或预测胶质母细胞瘤预后的产品，其特征在于，所述产品包括检测权利要求1所述的生物标志物cyp3a5表达水平的试剂。

3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸、高通量测序平台；

4.一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括靶向权利要求1所述生物标志物cyp3a5的抑制剂。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述抑制剂是指任何可降低编码cyp3a5核酸的表达、降低cyp3a5蛋白质水平，或抑制cyp3a5活性的物质，优选为降低cyp3a5蛋白的活性、降低cyp3a5基因或蛋白的稳定性、下调cyp3a5的表达、减少cyp3a5蛋白有效作用时间、或抑制cyp3a5的转录和翻译的物质；

6.一种应用，其特征在于，所述应用包括以下任一种：

7.根据权利要求6所述的应用，所述检测样本中生物标志物cyp3a5表达水平的试剂包括检测样本中生物标志物cyp3a5 mrna表达水平的试剂、和/或检测样本中生物标志物cyp3a5编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂；

8.一种调节胶质母细胞瘤细胞中cyp3a5表达水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将抑制stat3表达或活性、或促进stat3磷酸化的物质导入胶质母细胞瘤中。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当将抑制stat3表达或活性的物质导入胶质母细胞瘤中时，cyp3a5表达水平降低；当将促进stat3磷酸化的物质导入胶质母细胞瘤时，cyp3a5表达水平升高。

10.一种抑制胶质母细胞瘤细胞增殖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1所述的生物标志物cyp3a5的抑制剂导入到胶质母细胞瘤细胞中，任选地，所述抑制剂包括抑制stat3表达或活性的物质。

技术总结
本发明公开了靶向CYP3A5在胶质瘤治疗中的作用，本发明提供了一种与胶质瘤相关的生物标志物CYP3A5，其可用于胶质母细胞瘤的诊断、预后判断、预防和/或治疗，能够帮助临床医生对胶质瘤患者进行有效治疗，具有重要的临床应用价值。

技术研发人员：陈凌,胡文涛,刘嘉霖,康春生,刘鸿宇,崔晓腾,李泽
受保护的技术使用者：中国人民解放军总医院第一医学中心
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5