一种绣球花型KASP标记开发方法及其应用与流程
本发明属于植物分子标记辅助育种领域，具体涉及一种绣球花型kasp标记开发方法及其应用。
背景技术：
：：1、绣球(hydrangea macrophylla(thunb.)ser.)是虎耳草科绣球属落叶小灌木，又称紫阳花、八仙花。到如今，绣球也凭借其硕大的花序、丰富艳丽的花色(包括白、粉、蓝、紫、绿等)在花卉产业中得到了广泛的应用，从周年生产供应的鲜切花，到盆栽、庭院、专类园，再到大型园林中花卉景观营造都可以看见绣球的身影。2、绣球属植物原生种大多为伞房状聚伞花序，其观赏部位装饰花主要由叶片进化后的萼片组成。在大叶绣球中，通常包含圆球型与平顶型两种花型。其中平顶型花序由中央的非装饰花(non-decorative floret)和周围的装饰花(decorative floret)构成，整个花序近似在一个平面；圆球型花序则为一个球型，主要由装饰花组成。在绣球中，装饰花显然更加具有观赏价值，因此在绣球花型育种过程中育种者们也在不断尝试增加装饰花的数量以获得观赏性更好的栽培品种；因此对于绣球圆球型和平顶型两种花型的相关研究也在逐渐展开，希望能够揭示其遗传规律和控制基因，为后续的花型育种打下基础和提供参考。除花序类型外装饰花的重瓣性状也是重要的培育目标，而大叶绣球能兼顾花型与重瓣两个性状，是合适的花型育种材料。3、通过杂交育种试验，uemachi等发现平顶型花序品种与圆球型品种杂交f1代全部为平顶型花序，f1代自交所得f2代平顶型与圆球型花型比例为预期的3：1，符合孟德尔分离定律，推测花型性状可能为单个主基因控制；waki等在通过dna测序技术，设计ssr引物构建绣球遗传图谱，连锁分析结果表示绣球的重瓣和圆球型花序性均状由单个隐性基因控制，但试验过程中的f2代群体花型性状分离比为1：10，而不是预期的1：3；wu等利用5803个snp位点对82份大叶绣球进行全基因组关联分析，筛选出一个与花型显著相关的snp位点，并对18份绣球材料通过snp位点鉴定花型正确率达100％，然而在对341株f1代植株中，该snp位点鉴定花型出现了与预期不符的情况。4、目前对于绣球花型的相关研究虽多，但却也未能完全解释圆球型花序形成的机制与控制该性状的基因，因此还需进一步分析研究。技术实现思路1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种与绣球花型关联度高的kasp标记开发方法，及基于该kasp标记构建绣球花型预测模型。2、为了达到上述目的，本发明提供了一种绣球花型kasp标记的开发方法，包括以下步骤：3、(1)基于重测序数据，通过gwas分析获得与花型相关snp位点；4、(2)对步骤(1)中的数据进行筛选，选择每个scaffold中-log10(p)值高的前1～20个snp位点；5、(3)在多个绣球品种中，通过dna测序和kasp两种方法对步骤(2)中筛选的snp位点进行基因分型验证，最终确认用于绣球花型鉴定的kasp标记。6、本发明对gwas分析获得与花型相关snp位点进行筛选，并通过dna测序和kasp两种方法进行基因分型验证，由此确认的snp位点与绣球花型性状相关性更高。7、其中，步骤(1)中gwas分析的群体选取f1代杂交群体，母本‘蒂沃利’，为圆球型花序，父本‘塔贝’为平顶型花序。8、gwas分析的具体步骤如下：9、选取绣球植株，采摘新鲜无病虫害嫩叶，进行测序和数据分析；选择表型差异明显的形状，于植株盛花期时进行观测记录，对观测获得的原始数据进行处理，剔除异常值；选取dna检测结果合格的样本进行全基因组重测序；并将原始测序数据进行序列比对与群体snp检测；通过主成分与亲缘关系分析分别获得pc值和亲缘关系分析矩阵；对各性状的表型值与基因型值进行关联分析，筛选获得显著位点。10、本发明还提供了用于鉴定绣球花型的kasp标记，包括snp1、snp3、snp4、snp8、snp10、snp11和snp12中的一种或多种；各位点分别如下：11、snp1位于scaffold hma1.2p1_0653f.1的460462位，该位点由g突变为a；12、snp3位于scaffold hma1.2p1_0669f.1的220821位，该位点由g突变为a；13、snp4位于scaffold hma1.2p1_0669f.1的949341位，该位点由t突变为g；14、snp8位于scaffoldhma1.2p1_1283f.1的78611位，该位点由c突变为t；15、snp10位于scaffoldhma1.2p1_0060f.1的796640位，该位点由c突变为t；16、snp11位于scaffoldhma1.2p1_0060f.1的1540773位，该位点由g突变为c；17、snp12位于scaffoldhma1.2p1_0653f.1的868484位，该位点由a突变为t。18、其中，19、snp1位点上圆球型花序中基因型g/g的比例为100％；20、snp3位点上基因型g/g中85.2％为圆球型，基因型a/a中为平顶型的比例为100％；21、snp4位点上基因型g/g中81.6％为圆球型，基因型t/t中为平顶型的比例为87.9％；22、snp8位点上圆球型花序中基因型c/c的比例为97.9％；23、snp10位点上基因型t/t中92.3％为圆球型，基因型c/c中为平顶型的比例为88.0％；24、snp11位点上基因型c/c中85.4％为圆球型，基因型g/g中为平顶型的比例为90.3％；25、snp12位点上基因型t/t中88.9％为圆球型，基因型a/a中为平顶型的比例为89.3％。26、本发明还提供了用于鉴定绣球花型的kasp引物组合物，包括snp1引物、snp3引物、snp4引物、snp8引物、snp10引物、smp11引物和snp12引物中的一种或多种；各引物核苷酸序列如下表1所示。27、表1用于kasp的引物序列28、table 1 the primers used for kasp29、30、注：引物中加下划线部分为snp位点31、note:the underlined part of the primer is snp site32、本发明还提供了一种基于kasp标记进行绣球花型预测方法，具体方法如下：以gwas群体中重测序分型数据和品种及杂交后代中验证分型数据的组合为训练数据集，使用rfimpute函数自动补齐其中少量缺失值；运用gini系数和accuracy系数评估每个snp位点对于绣球花型性状的重要性，筛选出候选snp标记；利用随机森林算法进行模型构建，从候选snp标记中选择3个、4个和5个标记分别进行模型构建，获得不同标记数的最优模型，采用最优模型进行绣球植株的花型预测。33、在部分实施例中，最优模型中3标记模型的标记组合为：snp12、snp8、snp3；4标记模型的标记组合为：snp11、snp1、snp8、snp3；5标记模型的标记组合为：snp10、snp11、snp1、snp8、snp3。34、本发明相比现有技术具有以下优点：35、本发明通过对gwas分析获得的与花型相关snp位点基于重测序数据进行筛选，并利用kasp分型方法进行验证分析，得到与花型形状关联性高的snp位点。36、对snp标记进行筛选，利用随机森林算法进行模型构建，获得绣球花型预测的最优模型和参数设置，由此实现对未知花型的绣球植株预测。37、本发明筛选出的snp位点在绣球品种中展现出了多态性，且与花序类型这一性状紧密相关。同时利用snp位点构建的绣球花型预测模型准确性高。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
技术总结
本发明公开了一种绣球花型KASP标记的开发方法及其应用。本发明KASP标记的开发方法包括以下步骤：（1）通过GWAS分析获得与花型相关SNP位点基于重测序数据分型数据；（2）对步骤（1）中的数据进行筛选，选择每个Scaffold中‑log10(P)值高的前1~20个SNP位点；（3）在多个绣球品种中，通过DNA测序和KASP两种方法对步骤（2）中筛选的SNP位点进行基因分型验证，最终确认用于绣球花型鉴定的KASP标记。本发明对GWAS分析获得与花型相关SNP位点进行筛选，并通过DNA测序和KASP两种方法进行基因分型验证，由此确认的SNP位点与绣球花型性状相关性更高，为后续的花型育种提供了参考。
技术研发人员：秦俊,刘群录,邱帅,杨君,高凯,张宪权,唐琦琪,李金帅
受保护的技术使用者：上海辰山植物园
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5
背景技术：
：：1、绣球(hydrangea macrophylla(thunb.)ser.)是虎耳草科绣球属落叶小灌木，又称紫阳花、八仙花。到如今，绣球也凭借其硕大的花序、丰富艳丽的花色(包括白、粉、蓝、紫、绿等)在花卉产业中得到了广泛的应用，从周年生产供应的鲜切花，到盆栽、庭院、专类园，再到大型园林中花卉景观营造都可以看见绣球的身影。2、绣球属植物原生种大多为伞房状聚伞花序，其观赏部位装饰花主要由叶片进化后的萼片组成。在大叶绣球中，通常包含圆球型与平顶型两种花型。其中平顶型花序由中央的非装饰花(non-decorative floret)和周围的装饰花(decorative floret)构成，整个花序近似在一个平面；圆球型花序则为一个球型，主要由装饰花组成。在绣球中，装饰花显然更加具有观赏价值，因此在绣球花型育种过程中育种者们也在不断尝试增加装饰花的数量以获得观赏性更好的栽培品种；因此对于绣球圆球型和平顶型两种花型的相关研究也在逐渐展开，希望能够揭示其遗传规律和控制基因，为后续的花型育种打下基础和提供参考。除花序类型外装饰花的重瓣性状也是重要的培育目标，而大叶绣球能兼顾花型与重瓣两个性状，是合适的花型育种材料。3、通过杂交育种试验，uemachi等发现平顶型花序品种与圆球型品种杂交f1代全部为平顶型花序，f1代自交所得f2代平顶型与圆球型花型比例为预期的3：1，符合孟德尔分离定律，推测花型性状可能为单个主基因控制；waki等在通过dna测序技术，设计ssr引物构建绣球遗传图谱，连锁分析结果表示绣球的重瓣和圆球型花序性均状由单个隐性基因控制，但试验过程中的f2代群体花型性状分离比为1：10，而不是预期的1：3；wu等利用5803个snp位点对82份大叶绣球进行全基因组关联分析，筛选出一个与花型显著相关的snp位点，并对18份绣球材料通过snp位点鉴定花型正确率达100％，然而在对341株f1代植株中，该snp位点鉴定花型出现了与预期不符的情况。4、目前对于绣球花型的相关研究虽多，但却也未能完全解释圆球型花序形成的机制与控制该性状的基因，因此还需进一步分析研究。技术实现思路1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种与绣球花型关联度高的kasp标记开发方法，及基于该kasp标记构建绣球花型预测模型。2、为了达到上述目的，本发明提供了一种绣球花型kasp标记的开发方法，包括以下步骤：3、(1)基于重测序数据，通过gwas分析获得与花型相关snp位点；4、(2)对步骤(1)中的数据进行筛选，选择每个scaffold中-log10(p)值高的前1～20个snp位点；5、(3)在多个绣球品种中，通过dna测序和kasp两种方法对步骤(2)中筛选的snp位点进行基因分型验证，最终确认用于绣球花型鉴定的kasp标记。6、本发明对gwas分析获得与花型相关snp位点进行筛选，并通过dna测序和kasp两种方法进行基因分型验证，由此确认的snp位点与绣球花型性状相关性更高。7、其中，步骤(1)中gwas分析的群体选取f1代杂交群体，母本‘蒂沃利’，为圆球型花序，父本‘塔贝’为平顶型花序。8、gwas分析的具体步骤如下：9、选取绣球植株，采摘新鲜无病虫害嫩叶，进行测序和数据分析；选择表型差异明显的形状，于植株盛花期时进行观测记录，对观测获得的原始数据进行处理，剔除异常值；选取dna检测结果合格的样本进行全基因组重测序；并将原始测序数据进行序列比对与群体snp检测；通过主成分与亲缘关系分析分别获得pc值和亲缘关系分析矩阵；对各性状的表型值与基因型值进行关联分析，筛选获得显著位点。10、本发明还提供了用于鉴定绣球花型的kasp标记，包括snp1、snp3、snp4、snp8、snp10、snp11和snp12中的一种或多种；各位点分别如下：11、snp1位于scaffold hma1.2p1_0653f.1的460462位，该位点由g突变为a；12、snp3位于scaffold hma1.2p1_0669f.1的220821位，该位点由g突变为a；13、snp4位于scaffold hma1.2p1_0669f.1的949341位，该位点由t突变为g；14、snp8位于scaffoldhma1.2p1_1283f.1的78611位，该位点由c突变为t；15、snp10位于scaffoldhma1.2p1_0060f.1的796640位，该位点由c突变为t；16、snp11位于scaffoldhma1.2p1_0060f.1的1540773位，该位点由g突变为c；17、snp12位于scaffoldhma1.2p1_0653f.1的868484位，该位点由a突变为t。18、其中，19、snp1位点上圆球型花序中基因型g/g的比例为100％；20、snp3位点上基因型g/g中85.2％为圆球型，基因型a/a中为平顶型的比例为100％；21、snp4位点上基因型g/g中81.6％为圆球型，基因型t/t中为平顶型的比例为87.9％；22、snp8位点上圆球型花序中基因型c/c的比例为97.9％；23、snp10位点上基因型t/t中92.3％为圆球型，基因型c/c中为平顶型的比例为88.0％；24、snp11位点上基因型c/c中85.4％为圆球型，基因型g/g中为平顶型的比例为90.3％；25、snp12位点上基因型t/t中88.9％为圆球型，基因型a/a中为平顶型的比例为89.3％。26、本发明还提供了用于鉴定绣球花型的kasp引物组合物，包括snp1引物、snp3引物、snp4引物、snp8引物、snp10引物、smp11引物和snp12引物中的一种或多种；各引物核苷酸序列如下表1所示。27、表1用于kasp的引物序列28、table 1 the primers used for kasp29、30、注：引物中加下划线部分为snp位点31、note:the underlined part of the primer is snp site32、本发明还提供了一种基于kasp标记进行绣球花型预测方法，具体方法如下：以gwas群体中重测序分型数据和品种及杂交后代中验证分型数据的组合为训练数据集，使用rfimpute函数自动补齐其中少量缺失值；运用gini系数和accuracy系数评估每个snp位点对于绣球花型性状的重要性，筛选出候选snp标记；利用随机森林算法进行模型构建，从候选snp标记中选择3个、4个和5个标记分别进行模型构建，获得不同标记数的最优模型，采用最优模型进行绣球植株的花型预测。33、在部分实施例中，最优模型中3标记模型的标记组合为：snp12、snp8、snp3；4标记模型的标记组合为：snp11、snp1、snp8、snp3；5标记模型的标记组合为：snp10、snp11、snp1、snp8、snp3。34、本发明相比现有技术具有以下优点：35、本发明通过对gwas分析获得的与花型相关snp位点基于重测序数据进行筛选，并利用kasp分型方法进行验证分析，得到与花型形状关联性高的snp位点。36、对snp标记进行筛选，利用随机森林算法进行模型构建，获得绣球花型预测的最优模型和参数设置，由此实现对未知花型的绣球植株预测。37、本发明筛选出的snp位点在绣球品种中展现出了多态性，且与花序类型这一性状紧密相关。同时利用snp位点构建的绣球花型预测模型准确性高。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种绣球花型kasp标记的开发方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.一种鉴定绣球花型的kasp标记，其特征在于，包括snp1、snp3、snp4、snp8、snp10、snp11和snp12中的一种或多种；
3.一种鉴定绣球花型的kasp引物组合物，包括snp1引物、snp3引物、snp4引物、snp8引物、snp10引物、smp11引物和snp12引物中的一种或多种；
4.一种绣球花型预测方法，其特征在于，具体方法如下：以gwas群体中重测序分型数据和品种及杂交后代中验证分型数据的组合为训练数据集，使用rfimpute函数自动补齐其中少量缺失值；运用gini系数和accuracy系数评估每个snp位点对于绣球花型性状的重要性，筛选出候选snp标记；利用随机森林算法进行模型构建，从候选snp标记中选择3个、4个和5个标记分别进行模型构建，获得不同标记数的最优模型，采用最优模型进行绣球植株的花型预测。
5.根据权利要求4所述的绣球花型预测方法，其特征在于，所述最优模型中3标记模型的标记组合为：snp12、snp8、snp3，4标记模型的标记组合为：snp11、snp1、snp8、snp3，5标记模型的标记组合为：snp10、snp11、snp1、snp8、snp3；
技术总结
本发明公开了一种绣球花型KASP标记的开发方法及其应用。本发明KASP标记的开发方法包括以下步骤：（1）通过GWAS分析获得与花型相关SNP位点基于重测序数据分型数据；（2）对步骤（1）中的数据进行筛选，选择每个Scaffold中‑log10(P)值高的前1~20个SNP位点；（3）在多个绣球品种中，通过DNA测序和KASP两种方法对步骤（2）中筛选的SNP位点进行基因分型验证，最终确认用于绣球花型鉴定的KASP标记。本发明对GWAS分析获得与花型相关SNP位点进行筛选，并通过DNA测序和KASP两种方法进行基因分型验证，由此确认的SNP位点与绣球花型性状相关性更高，为后续的花型育种提供了参考。
技术研发人员：秦俊,刘群录,邱帅,杨君,高凯,张宪权,唐琦琪,李金帅
受保护的技术使用者：上海辰山植物园
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5
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