杀昆虫蛋白及其使用方法与流程

本公开涉及分子生物学领域。提供了编码杀有害生物蛋白的新颖基因。这些杀有害生物蛋白和编码它们的核酸序列可用于制备杀有害生物制剂和生产有害生物抗性转基因植物。提供了用来产生或改变杀有害生物蛋白的方法，以便改变或增强杀有害生物活性。

背景技术：

1、使用微生物剂(如真菌、细菌或其他昆虫物种)对具有农业意义的昆虫有害生物进行生物控制，为合成型化学杀有害生物剂提供了环境友好且有商业吸引力的替代方案。一般来说，使用生物杀有害生物剂造成污染和环境危害的风险较低，并且生物杀有害生物剂提供比传统广谱化学杀昆虫剂所特有的靶特异性更强的靶特异性。另外，生物杀有害生物剂往往生产成本较低，并且因此能提高各种作物的经济产量。

2、已知芽孢杆菌属(bacillus)微生物的某些物种对一系列昆虫有害生物具有杀有害生物活性，所述昆虫有害生物包括鳞翅目(lepidoptera)、双翅目(diptera)、鞘翅目(coleoptera)、半翅目(hemiptera)等。苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis，bt)和日本金龟子芽孢杆菌(bacillus popilliae)是迄今为止发现的最成功的生物控制剂。昆虫致病性还归因于幼虫芽孢杆菌(b.larvae)、缓病芽孢杆菌(b.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(b.sphaericus)和蜡状芽孢杆菌(b.cereus)的菌株。微生物杀昆虫剂，特别是从芽孢杆菌属菌株获得的那些微生物杀昆虫剂，作为有害生物化学控制的替代品在农业上起着重要作用。

3、通过将作物植物进行遗传工程改造以从芽孢杆菌属产生杀有害生物蛋白，已经开发出抗昆虫增强的作物植物。例如，已经对玉米和棉花植物进行遗传工程改造以产生从苏云金芽孢杆菌菌株分离的杀有害生物蛋白。现在，这些经遗传工程改造的作物广泛应用于农业中，并且为农民提供了取代传统昆虫控制方法的环境友好型替代方案。虽然它们已被证明在商业上非常成功，但是这些经遗传工程改造的抗昆虫作物植物可能仅针对窄范围的经济上重要的昆虫有害生物提供抗性。在一些情况下，昆虫可以对不同杀昆虫化合物产生抗性，这就导致需要鉴定用于有害生物控制的替代性生物控制剂。

4、因此，仍然需要对昆虫有害生物具有不同范围的杀昆虫活性的新颖杀有害生物蛋白，例如对鳞翅目和鞘翅目中的各种昆虫具有活性的杀昆虫蛋白，所述昆虫包括但不限于已对现存杀昆虫剂产生抗性的昆虫有害生物。

技术实现思路

1、在一个方面，提供了用于对细菌、植物、植物细胞、组织以及种子赋予杀有害生物活性的组合物和方法。组合物包括杀有害生物和杀昆虫多肽的核酸分子编码序列、包含那些核酸分子的载体、以及包含所述载体的宿主细胞。组合物还包括所述杀有害生物多肽序列以及针对那些多肽的抗体。组合物还包含经转化的细菌、植物、植物细胞、组织以及种子。

2、在另一方面，提供了编码改组的cry毒素多肽的分离或重组的核酸分子，所述多肽包括氨基酸取代、缺失、插入、及其片段。提供了能够编码seq id no:57-112和275-278以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合的改组的cry毒素多肽的分离或重组的核酸分子。在某些实施例中，提供了编码杀昆虫多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含如seq idno:57-112、214-246、和275-278中任一项所示的核酸序列。还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的核酸序列。所述核酸序列可以在dna构建体或表达盒中使用，以用于在多种生物体(包括微生物和植物)中进行转化和表达。所述核苷酸或氨基酸序列可以是合成序列，所述合成序列已经被设计用于在生物体中表达，所述生物体包括但不限于：微生物或植物。

3、在另一方面，涵盖了改组的cry毒素多肽。还提供了seq id no:57-112和275-278的分离或重组的改组的cry毒素多肽以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。

4、在另一方面，提供了用于产生多肽和使用那些多肽来控制或杀灭鳞翅目、鞘翅目、线虫、真菌、和/或双翅目有害生物的方法。实施例的转基因植物表达本文公开的杀有害生物序列中的一种或多种。在不同实施例中，所述转基因植物进一步包含一种或多种另外的抗昆虫基因，例如，用于控制鞘翅目、鳞翅目、半翅目或线虫有害生物的一种或多种另外的基因。本领域技术人员将理解，所述转基因植物可以包含赋予目的农艺性状的任何基因。

5、在另一方面，还包括用于在样品中检测实施例的核酸和多肽的方法。提供了用于在样品中检测改组的cry毒素多肽的存在或检测编码改组的cry毒素多肽的多核苷酸的存在的试剂盒。所述试剂盒可以与实施预期试剂检测的方法所需的所有试剂和对照样品，以及使用说明书一起提供。

6、在另一方面，实施例的所述组合物和方法可用于产生具有增强的有害生物抗性或耐受性的生物体。这些生物体以及包含所述生物体的组合物对于农业目的是所希望的。实施例的组合物还可用于产生具有杀有害生物活性的经改变或改善的蛋白质，或用于检测改组的cry毒素多肽的存在。

7、在另一方面，提供了用于改组cry毒素多肽的方法，所述方法包括将结构域1(dm1)的α环结构域从第一cry毒素交换到第二cry毒素中。在一些实施例中，改组的cry毒素多肽具有改变的活性谱。在另一个实施例中，改组的cry毒素多肽具有改变量的杀有害生物活性。在一些实施例中，改组的cry毒素多肽具有改变的作用模式或作用位点。在一些实施例中，所述改组包括将α环2、3、4、5和/或6从第一cry毒素交换到第二cry毒素中。在一些实施例中，所述cry毒素是天然的cry毒素。在一些实施例中，所述cry毒素是改组或杂合的cry毒素。

技术特征：

1.一种杀昆虫多肽，所述杀昆虫多肽包含seq id no:62的氨基酸序列。

2.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码权利要求1的杀昆虫多肽。

3.根据权利要求2所述的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸包含seq id no:6的核酸序列。

4.一种dna构建体，所述dna构建体包含权利要求2的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4的dna构建体，其中所述宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或两栖动物细胞。

6.一种产生转基因植物的方法，所述方法包括将权利要求4的dna构建体引入植物细胞。

7.一种重组杀昆虫多肽，所述重组杀昆虫多肽具有seq id no:62的氨基酸序列，其中所述重组杀昆虫多肽具有杀昆虫活性。

8.一种组合物，所述组合物包含至少一种权利要求7的重组杀昆虫多肽。

9.一种重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码权利要求7的杀昆虫多肽。

10.根据权利要求9所述的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸具有经优化用于在农业上重要的作物中表达的密码子。

11.根据权利要求9所述的重组多核苷酸，其中所述重组多核苷酸包含具有seq id no:6的核酸序列。

12.根据权利要求9所述的重组多核苷酸，其中所述重组多核苷酸可操作地连接到异源启动子。

13.一种dna构建体，所述dna构建体包含可操作地连接到异源调节元件的权利要求9的重组多核苷酸。

14.一种用权利要求13的dna构建体转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或两栖动物细胞。

15.一种产生转基因植物的方法，所述方法包括将权利要求9的多核苷酸引入植物细胞。

16.一种产生转基因植物的方法，所述方法包括将权利要求13的dna构建体引入植物细胞。

17.一种抑制昆虫有害生物或有害生物群体的生长或将其杀灭的方法，所述方法包括使所述昆虫有害生物或有害生物群体与权利要求1的杀昆虫多肽接触。

18.一种抑制昆虫有害生物或有害生物群体的生长或将其杀灭的方法，所述方法包括在植物中表达权利要求2的多核苷酸。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述昆虫有害生物或有害生物群体对至少一种cry杀昆虫蛋白具有抗性。

20.一种dna构建体，所述dna构建体由多核苷酸和异源调节元件组成，所述多核苷酸编码具有seq id no:62的氨基酸序列的多肽，其中所述异源调节元件可操作地连接到所述多核苷酸。

21.根据权利要求20所述的dna构建体，其中所述多核苷酸包含具有seq id no:6的核酸序列。

22.一种产生转基因植物的方法，所述方法包括将权利要求20的dna构建体引入植物细胞。

技术总结
本发明涉及杀昆虫蛋白及其使用方法。本公开涉及分子生物学领域。提供了编码杀有害生物蛋白的新颖基因。这些杀有害生物蛋白和编码它们的核酸序列可用于制备杀有害生物制剂和生产有害生物抗性转基因植物。提供了用来产生或改变杀有害生物蛋白的方法，以便改变或增强杀有害生物活性。

技术研发人员：E·A·M·富克斯,N·K·卡卡尼,K·沃特,山本敬司,郑毅
受保护的技术使用者：先锋国际良种公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5