一种具有抗肿瘤协同作用的肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物及其制备方法和应用

本发明提供一种抗肿瘤协同作用的肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物的制备方法，及其作为纳米载体包载抗肿瘤药物的聚合物纳米粒的制备方法和应用，涉及药物制剂。

背景技术：

1、癌症是全球性的公共卫生问题，也是当前造成我国疾病负担的重要因素。药物治疗仍是临床中主要的干预手段之一。然而，低生物利用度、低靶向性与全身毒副作用大是影响化疗药有效性与患者用药依从性的重要因素。因此近年来，利用安全无毒、生物相容性良好的天然大分子改性化合物作为纳米载体实现化疗药的“增效减毒”受到较大关注。

2、1935年开始应用于临床的经典抗凝/抗血栓药物肝素(heparin，hep)是一种由哺乳动物肥大细胞合成的高度不均一的线性糖胺聚糖，由艾杜糖醛酸/葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖通过1-4连接(ua(1→4)glcn)构成的重复的二糖单元组成，平均分子量约为16kda，每个二糖单元带有不同程度的磺化和n-乙酰化修饰。hep主要从猪肠粘膜中提取而来，使用通过不同的化学或酶法将hep降解，即可得到平均分子量在4～6kda之间的低分子量肝素(lowmolecularweight heparin，lmwh)。

3、肝素/低分子量肝素丰富的硫酸盐和羧酸基团赋予肝素的高负电荷，可以在体内外介导其与无数呈正电性的蛋白质如乙酰肝素酶、基质金属蛋白酶、vegf、fgf、p/l-选择素等产生静电相互作用，影响肿瘤血管生成、肿瘤转移以及肿瘤间充质转化等过程，从而表现出出色的抗肿瘤生理活性。此外，肝素类物质结构上富含羟基、氨基、羧基等基团，有时低分子量肝素的末端还含有不饱和双键，因此可以通过离子相互作用或化学偶联与目标分子结合，按需求设计成性能优质的纳米药物递送载体。肿瘤中大量分裂的血管内皮细胞、血管壁中的凝血血浆蛋白网络、肿瘤微环境中高表达的肝素结合血管生长因子等因素使得肝素对肿瘤具有高度的亲和力。因此，肝素还具有发挥主动靶向作用，将纳米粒递送至肿瘤病灶部位，改善分布，增强疗效的潜力。

技术实现思路

1、针对上述情况，为克服当前化疗药靶向性差、生物利用度低、全身副作用大的缺陷，本发明提供了一种以青蒿琥酯对肝素类物质进行亲脂化修饰，制备肿瘤靶向纳米载体的方法，本发明以肝素/低分子量肝素作为亲水段，以青蒿琥酯作为亲脂段，用己二酰肼作为链接桥进行酰胺化反应，可克服空间位阻，形成ph敏感型的智能纳米载体。此外，本发明通过条件优化，可在避免因缩合剂引入杂质的同时，按需求调节亲水/亲脂段比例，亲脂段青蒿琥酯的质量百分含量最高可提升至33％。

2、为了实现上述目的，采用了如下技术方案：

3、首先，本发明提供一种具有抗肿瘤协同作用的肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物，具有通式ⅰ所示结构：

4、

5、所述聚合物中肝素/低分子量肝素的重均分子量为3～16kda，所述聚合物中青蒿琥酯的质量分数为1～33％。

6、优选地，所述聚合物中青蒿琥酯地质量分数为8～15％。

7、第二，本发明提供上述具有抗肿瘤协同作用的肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物的制备方法，方法包括以下步骤：

8、(1)在甲酰胺中加入肝素、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺对肝素进行活化反应，结束后加入无水乙醇使肝素活化产物沉淀，再向沉淀物中加入弱碱性pbs溶解的己二酰肼进行酰胺化聚合反应，得到肝素-己二酰肼中间物；

9、(2)在n,n-二甲基甲酰胺中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶对青蒿琥酯进行活化反应，结束后再加入水-n,n-二甲基甲酰胺混合溶解的步骤(1)所得肝素-己二酰肼中间物进行酰胺化聚合反应，得到肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物。

10、优选地，所述肝素按二糖单元计，与己二酰肼的摩尔比为1:(1～20)，更优选1:(5～15)；所述肝素按二糖单元计，与1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1～20):(1～40)，更优选1:(2～10):(4～20)；所述肝素-己二酰肼中间物:青蒿琥酯的摩尔比为1:(1～20)；所述青蒿琥酯、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:(1～6):(0.1～1)，更优选1:(2～5):(0.1～0.7)。

11、优选地，所述甲酰胺与无水乙醇的体积比为1:(3～9)，更优选1:(3～6)；所述水-n,n-二甲基甲酰胺混合溶剂中水与n,n-二甲基甲酰胺的体积比为1:(1～10)，更优选1:(5～10)。

12、优选地，所述聚合反应在搅拌条件下进行，所述肝素或青蒿琥酯的活化时间为0.5～12h；所述聚合反应的时间为2～48h，更优选24～48h。

13、优选地，所述弱碱性pbs的ph值为7.5～9.5，更优选8.0～8.5。

14、优选地，步骤(1)所述聚合反应后，还包括将所得反应液依次用nacl溶液、去离子水进行超滤或透析纯化；步骤(2)所述聚合反应后，还包括将所得反应液依次用乙醇-水溶液、nacl溶液、去离子水进行超滤或透析纯化。

15、优选地，所述透析用透析袋或超滤管的截留分子量为1～3kda；所述nacl溶液浓度为0.1～0.5m，更优选0.2m；所述乙醇-水溶液中无水乙醇与水的体积比为(0.2～3):1，更优选1:1。

16、优选地，所述纯化后产物应进行膜过滤和冷冻干燥；所述膜过滤用膜的孔径为0.45μm。

17、第三，本发明提供一种包载索拉非尼的聚合物纳米粒，所述聚合物纳米粒由上文所述技术方案中的肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物或上文所述技术方案中的制备方法得到的肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物在水性介质中自组装形成，所述包载索拉非尼的聚合物纳米粒中索拉非尼的质量含量为1～24％。

18、优选地，所述聚合物纳米粒为粒径50～250nm的球状纳米粒。

19、第四，本发明提供上述包载抗肿瘤小分子药的聚合物纳米粒的制备方法，方法包括以下步骤：将所述肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物与抗肿瘤小分子药溶解于有机溶剂中，然后将所得混合溶液滴入水性溶剂中搅拌，再依次透析、膜过滤和冷冻干燥，得到所述包载抗肿瘤小分子药的聚合物纳米粒。

20、优选地，所述抗肿瘤小分子药包括但不限于索拉非尼、阿霉素、紫杉醇等亲脂性小分子药物；所述肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物与抗肿瘤小分子药的质量比为1:(0.1～0.3)。

21、优选地，所述有机溶剂包括但不限于二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、甲酰胺、二氯甲烷等可以溶解亲脂性小分子的溶剂；所述水系溶剂包括但不限于蒸馏水、去离子水或pbs、生理盐水等缓冲盐溶液；所述有机溶剂与水系溶剂的体积比为1:(1～20)，更优选1:(5～10)；所述搅拌时间为20～90min，更优选30～60min；所述透析用透析袋的截留分子量为1～8kda，透析液为水，透析时间为1天，所述膜过滤用膜的孔径为0.45μm。

22、在所述透析过程中透析袋内水-有机溶剂混合溶剂中的有机溶剂透析到透析液中，水得以保留，透析袋内肝素-己二酰肼-青蒿琥酯聚合物中的疏水基团在水中形成内核，将亲脂小分子抗肿瘤药进行物理包裹，从而得到包载亲脂小分子抗肿瘤药的聚合物纳米粒。本发明通过透析法制备所述包载亲脂小分子抗肿瘤药的聚合物纳米粒，其粒径大小可控，粒子形态呈球形。

23、第五，本发明提供上文所述技术方案中的包载抗肿瘤药物的聚合物纳米粒或上文所述技术方案中的制备方法制备的包载抗肿瘤药物的聚合物纳米粒在制备抗肿瘤药治疗中的应用。

24、本发明本发明的有益效果：

25、含有过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物青蒿琥酯(artesunate，art)不仅是一种全身安全性较好的抗疟药物，还可以通过参与调节mek/erk信号、下调转化生长因子-β、肿瘤坏死因子-α、诱导氧化应激与溶酶体活化等过程在抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡以及克服癌细胞对化疗药的耐药性方面方面表现出出色的活性。因此，以青蒿琥酯作为亲脂材料修饰亲水性的肝素，具有构建出能发挥协同作用的肿瘤靶向纳米载体的潜力。

26、在过往的研究中，我们发现，用青蒿琥酯修饰肝素制备肿瘤靶向纳米载体，存在一些技术难点：第一，肝素是具有复杂结构的大分子，当进行肝素的青蒿琥酯修饰时，可能受空间位阻的影响反应效率低下，难以实现青蒿琥酯的高程度修饰。此外，肝素高度硫酸化的结构，可能会阻碍art的有效接枝。第二，在修饰过程中常用缩合剂(如edc、nhs)来促进酰胺键的形成，这些缩合剂可能引入杂质，影响最终产品的纯度和生物相容性。未充分去除的缩合剂可能导致毒性问题。第三，青蒿琥酯具有较强的亲脂性，而肝素则是亲水性分子。为了形成稳定的纳米载体，需要精确调节亲水/亲脂段的比例。过高的亲水性可能导致纳米载体不稳定，而亲脂性过高则可能影响载体在水性环境中的溶解度和分散性。然而亲脂段比例的提升可以增加纳米载体的疏水核心区域，从而提高药物的负载能力。亲脂性药物能够更有效地嵌入到载体的疏水核心中，提高药物的包封效率和载药量。亲脂段可以帮助形成更加稳定的核-壳结构，减少载体在血液循环中由于与血浆蛋白的相互作用而发生的聚集或崩解。亲脂段比例的提升可以调节药物释放的速度，疏水核心可以有效控制药物从纳米载体中的扩散速度，使药物能够在肿瘤微环境中特定条件下(如酸性ph值或高谷胱甘肽浓度)响应性释放，从而提高治疗效果。亲脂段的提升有助于纳米载体在肿瘤微环境中的滞留时间，肿瘤组织通常具有异常的血管结构和高通透性，亲脂性纳米载体能够更长时间地滞留在肿瘤组织中，从而提高药物的局部浓度和治疗效果，也就是能够增强靶向性。通过调节亲脂段比例，可以优化纳米载体的大小、表面电荷和形态等物理化学性质。这些性质对纳米载体在体内的分布、代谢和清除都有重要影响，可以进一步优化治疗效果和减少副作用。因此，制备稳定的亲脂段比例高的肝素青蒿琥酯修饰物是必要且有难度的。本发明通过修饰路线和条件的创新，克服了上述技术难点，合成的具有两亲性的肝素-己二酰肼-青蒿琥酯聚合物中亲脂段青蒿琥酯的质量百分含量最高可提升至33％。

27、本发明提供了一种肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物，具有通式ⅰ所示结构；所述共聚物中肝素的重均分子量为3～16kda，所述聚合物中青蒿琥酯的质量分数为1～33％。本发明以生物相容性良好且具有肿瘤靶向性的肝素为亲水性材料，以青蒿琥酯为疏水性集团，以己二酰肼为ph敏感连接桥，首次合成具有两亲性的肝素-己二酰肼-青蒿琥酯聚合物，该聚合物在水性介质中自组装形成聚合物纳米粒，能作为载体进行物理包载疏水性抗肿瘤药物，显著提高其载药量，改善在体分布。

28、本发明提供了一种包载抗肿瘤亲脂性小分子药物的聚合物纳米粒，所述聚合物由上述肝素-己二酰肼-青蒿琥酯在水性介质中自组装形成。本发明提供的包载抗肿瘤亲脂性小分子药物的聚合物纳米粒中亲脂性小分子药物的含量高，可高达24wt.％。

29、本发明提供了所述包载亲脂性小分子抗肿瘤药物的聚合物纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供的纳米粒中亲脂性小分子抗肿瘤药物的含量高，肿瘤靶向性强，抗肿瘤效果提升。实施例结果表明，本发明提供的包载亲脂性小分子抗癌药索拉非尼的聚合物纳米粒能提高索拉非尼在体外提高hepg2细胞的摄取作用与毒性作用、在体内提高索拉非尼在肿瘤部位的富集和肿瘤抑制作用，提高药效。

技术特征：

1.一种具有抗肿瘤协同作用的肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物，其特征在于，具有通式ⅰ所示结构：

2.一种权利要求1所述的具有抗肿瘤协同作用的肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述肝素按二糖单元计，与己二酰肼的摩尔比为1:(1～20)；所述肝素按二糖单元计，与1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1～20):(1～40)；所述肝素-己二酰肼中间物:青蒿琥酯的摩尔比为1:(1～20)；所述青蒿琥酯、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:(1～6):(0.1～1)；所述甲酰胺与无水乙醇的体积比为1:(3～9)；所述水-n,n-二甲基甲酰胺混合溶剂中水与n,n-二甲基甲酰胺的体积比为1:(1～10)。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述聚合反应在搅拌条件下进行，所述肝素或青蒿琥酯的活化时间为0.5～12h；所述聚合反应的时间为2～48h；所述弱碱性pbs的ph值为7.5～9.5。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述聚合反应后，还包括将所得反应液依次用nacl溶液、去离子水进行超滤或透析纯化；步骤(2)所述聚合反应后，还包括将所得反应液依次用乙醇-水溶液、nacl溶液、去离子水进行超滤或透析纯化。

6.根据权利要求5所述透析方法，其特征在于：所述透析用透析袋或超滤管的截留分子量为1～3kda；所述nacl溶液浓度为0.1～0.5m；所述乙醇-水溶液中无水乙醇与水的体积比为(0.2～3):1；所述纯化后产物应进行膜过滤和冷冻干燥；所述膜过滤用膜的孔径为0.45μm。

7.一种包载索拉非尼的聚合物纳米粒，其特征在于，所述聚合物纳米粒由权利要求1所述的肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物或权利要求2～9任意一项所述制备方法得到的肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物在水性介质中自组装形成，所述包载索拉非尼的聚合物纳米粒中索拉非尼的质量含量为1～24％。

8.根据权利要求7所述的包载抗肿瘤小分子药的聚合物纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物与抗肿瘤小分子药溶解于有机溶剂中，然后将所得混合溶液滴入水性溶剂中搅拌，再依次透析、膜过滤和冷冻干燥，得到所述包载抗肿瘤小分子药的聚合物纳米粒。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤小分子药包括但不限于索拉非尼、阿霉素、紫杉醇；所述肝素-己二酰肼-青蒿琥酯接枝共聚物与抗肿瘤小分子药的质量比为1:(0.1～0.3)；所述有机溶剂包括二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、甲酰胺、二氯甲烷；所述水系溶剂包括蒸馏水、去离子水或pbs、生理盐水；所述有机溶剂与水系溶剂的体积比为1:(1～20)；所述搅拌时间为20～90min；所述透析用透析袋的截留分子量为1～8kda，透析液为水，透析时间为1天，所述膜过滤用膜的孔径为0.45μm。

10.权利要求7所述的包载抗肿瘤药物的聚合物纳米粒或权利要求8～9任意一项所述制备方法得到的包载抗肿瘤药物的聚合物纳米粒在制备抗肿瘤药治疗中的应用。

技术总结
本发明公开了具有抗肿瘤协同作用的肝素‑己二酰肼‑青蒿琥酯接枝共聚物及其制备方法和应用，涉及药物制剂技术领域，该聚合物具有通式Ⅰ所示结构：所述聚合物中肝素的重均分子量为3～16kDa，所述聚合物中青蒿琥酯的质量分数为1～33％。本发明首次合成两亲性的肝素‑己二酰肼‑青蒿琥酯接枝聚合物。该聚合物即能在水性介质中直接自组装形成粒径为1～1000nm的聚合物纳米粒，产生肿瘤抑制作用。也能作为载体包载抗癌药物，形成的纳米粒载药量高，可达24％。形成的纳米粒在体液生理环境下保持稳定，并能将药物靶向递送至肿瘤部位，在肿瘤周围酸性pH环境下有效释放抗肿瘤药物，提高抗肿瘤效果。

技术研发人员：张真庆,田禾,何玉,骆玉霞,易琳,欧阳艺兰
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5