一种鉴别冬虫夏草粉原料规格等级的方法与流程

本发明涉及中药材检测，具体涉及一种鉴别冬虫夏草粉原料规格等级的方法。

背景技术：

1、冬虫夏草(cordycepssinensis)是我国传统名贵中药材，其主要生长于西藏、青海、四川等高海拔山区，具有补肾益肺、止血化痰的功效。传统市场冬虫夏草销售时按规格大小可分为不同的等级。而规格越大的冬虫夏草生长越为困难、资源更加稀缺，造成规格越大、价格越高的现状。关于冬虫夏草规格大小与其内在成分的关联性研究极少，前期有文献研究了不同等级冬虫夏草的核苷类成分，结果显示不同等级冬虫夏草中核苷类成分无显著差异。

2、目前对于不同规格等级的冬虫夏草原药材，尚可通过每公斤冬虫夏草的条数或每根冬虫夏草的重量、感官检查等手段进行判断，但对于冬虫夏草粉的原药材规格等级，尚无鉴定手段。专利cn102890091 b采用了显微染色法鉴别纯冬虫夏草粉的真伪，专利申请cn103898236b公开了检测冬虫夏草超微粉中是否添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对、试剂盒和方法。这些技术主要解决冬虫夏草粉的真伪鉴别问题，但无法鉴别冬虫夏草粉的原料规格等级。

3、因此，亟需一种鉴别冬虫夏草粉的原料规格等级的方法。

技术实现思路

1、针对现有技术方法的不足，本发明建立了一种鉴别冬虫夏草粉的原料规格等级的方法。

2、一种鉴别冬虫夏草粉原料规格等级的方法，其包括：取冬虫夏草粉，检测特定多糖组分含量，从而鉴别冬虫夏草粉的原料规格等级。

3、在一些实施例中，所述特定多糖组分的重均分子量为5×105da＜mw＜3×106da。

4、在一些实施例中，所述检测特定多糖组分含量包括检测总多糖在冬虫夏草粉中的含量和检测多糖组分分子量分布，进而计算出特定多糖组分在冬虫夏草粉中的含量。

5、所述检测特定多糖组分分子量分布为检测重均分子量为5×105da＜mw＜3×106da的多糖组分在重均分子量为1×103da～1×107da的多糖组分中的占比。

6、在一些实施例中，所述计算特定多糖组分含量包括计算冬虫夏草粉中重均分子量为5×105da＜mw＜3×106da的多糖组分在冬虫夏草粉中的含量。

7、在一些实施例中，所述方法包括通过检测特定多糖组分含量来鉴别冬虫夏草粉的原料规格等级。

8、在一些实施例中，以冬虫夏草粉的总质量计算，冬虫夏草粉中重均分子量为5×105da＜mw＜3×106da的多糖组分在冬虫夏草粉中的含量低于2.1g/100g的冬虫夏草粉的原料为小规格的冬虫夏草。

9、在一些实施例中，以冬虫夏草粉的总质量计算，重均分子量为5×105da＜mw＜3×106da的多糖组分含量不低于2.1g/100g的冬虫夏草粉的原料为大规格的冬虫夏草。

10、在一些实施例中，以冬虫夏草粉的总质量计算，冬虫夏草粉中重均分子量为5×105da＜mw＜3×106da的多糖组分在冬虫夏草粉中的含量低于2.0g/100g、1.9g/100g、1.8g/100g、1.7g/100g或1.6g/100g的冬虫夏草粉的原料为小规格的冬虫夏草。在一些实施例中，以冬虫夏草粉的总质量计算，冬虫夏草粉中重均分子量为5×105da＜mw＜3×106da的多糖组分在冬虫夏草粉中的含量为0.48g/100g～1.88g/100g的冬虫夏草粉的原料为小规格的冬虫夏草。

11、在一些实施例中，以冬虫夏草粉的总质量计算，重均分子量为5×105da＜mw＜3×106da的多糖组分含量为2.1g/100g～8.0g/100g的冬虫夏草粉的原料为大规格的冬虫夏草。在一些实施例中，以冬虫夏草粉的总质量计算，重均分子量为5×105da＜mw＜3×106da的多糖组分含量为2.17g/100g～8.01g/100g的冬虫夏草粉的原料为大规格的冬虫夏草。

12、在一些实施例中，所述重均分子量为5×105da＜mw＜3×106da的多糖组分在冬虫夏草粉中的含量的计算公式为：a＝ω×p；其中，

13、a为冬虫夏草中重均分子量为5×105da＜mw＜3×106da的多糖组分在冬虫夏草中的含量，单位为g/100g或换算为g/100g；

14、ω为冬虫夏草中多糖在冬虫夏草中的含量，单位为g/100g或换算为g/100g；

15、p为冬虫夏草中重均分子量为5×105da＜mw＜3×106da的多糖组分的峰面积在1×103da～1×107da的多糖组分的总峰面积中的占比。

16、在一些实施例中，所述小规格的冬虫夏草为每条重量≤0.25g的冬虫夏草。在一些实施例中，所述小规格的冬虫夏草为0.15g/条～0.25g/条的冬虫夏草。在一些实施例中，所述小规格的冬虫夏草为0.15g/条～0.24g/条的冬虫夏草。

17、在一些实施例中，所述大规格的冬虫夏草为每条重量≥0.35g的冬虫夏草。在一些实施例中，所述大规格的冬虫夏草为0.35g/条～0.60g/条的冬虫夏草。

18、在一些实施例中，所述小规格的冬虫夏草为每千克冬虫夏草的条数不少于4800条的冬虫夏草。在一些实施例中，所述小规格的冬虫夏草为每千克冬虫夏草的条数为4800～5618条/kg的冬虫夏草。在一些实施例中，所述小规格的冬虫夏草为4800～5600条/kg的冬虫夏草。

19、在一些实施例中，所述大规格的冬虫夏草为每千克冬虫夏草的条数不多于2700条的冬虫夏草。在一些实施例中，所述大规格的冬虫夏草为1800～2700条/kg的冬虫夏草。在一些实施例中，所述大规格的冬虫夏草为2100～2700条/kg的冬虫夏草。

20、在一些实施例中，所述方法采用硫酸-苯酚法测定总多糖含量。

21、在一些实施例中，所述方法还包括采用高效液相色谱法测定特定多糖组分分子量分布。

22、在一些实施例中，所述高效液相色谱法采用凝胶色谱柱作为色谱柱。

23、在一些实施例中，所述高效液相色谱法的流动相为乙酸铵水溶液或甲酸铵水溶液中的至少一种。

24、在一些实施例中，所述高效液相色谱法采用等度洗脱的洗脱方式进行洗脱。

25、在一些实施例中，所述高效液相色谱法采用蒸发光散射检测器进行检测。

26、在一些实施例中，所述高效液相色谱法采用凝胶色谱柱作为色谱柱，以乙酸铵水溶液或甲酸铵水溶液中的至少一种为流动相进行等度洗脱，采用蒸发光散射检测器进行检测。

27、在一些实施例中，所述高效液相色谱法的流动相为硫酸钠水溶液、醋酸钠水溶液或磷酸二氢钠水溶液中的至少一种。

28、在一些实施例中，所述高效液相色谱法采用示差折光检测器进行检测。

29、在一些实施例中，所述高效液相色谱法采用凝胶色谱柱，以硫酸钠水溶液、醋酸钠水溶液或磷酸二氢钠水溶液中的至少一种为流动相进行等度洗脱，采用示差折光检测器进行检测。

30、在一些实施例中，所述凝胶色谱柱为tsk gel super multipore pw-h。

31、在一些实施例中，所述凝胶色谱柱的规格为柱长100mm～300mm，内径4.6mm～10.0mm，填料粒径5μm～10μm。在一些实施例中，所述凝胶色谱柱的规格为柱长150mm，内径6.0mm，填料粒径8μm。

32、在一些实施例中，所述凝胶色谱柱为tsk gel super multipore pw-h，所述凝胶色谱柱的规格为柱长150mm，内径6.0mm，填料粒径8μm。

33、在一些实施例中，所述流动相为0.05mol/l～0.20mol/l的乙酸铵水溶液或0.05mol/l～0.20mol/l的甲酸铵水溶液。在一些实施例中，所述流动相为0.1mol/l的乙酸铵水溶液或0.1mol/l的甲酸铵水溶液。

34、在一些实施例中，所述高效液相色谱法的流动相流速为0.3ml/min～0.5ml/min。在一些实施例中，所述高效液相色谱法的流动相流速为0.4ml/min。

35、在一些实施例中，所述高效液相色谱法的柱温为30℃～40℃。在一些实施例中，所述高效液相色谱法的柱温为35℃。

36、在一些实施例中，所述蒸发光散射检测器采用惰性气体为载气。在一些实施例中，所述蒸发光散射检测器采用氮气为载气。

37、在一些实施例中，所述载气的压力为3.0bar～4.0bar。在一些实施例中，所述载气的压力为3.5bar。

38、在一些实施例中，所述蒸发光散射的漂移管温度为35℃～80℃。在一些实施例中，所述蒸发光散射的漂移管温度为40℃～70℃。在一些实施例中，所述蒸发光散射的漂移管温度为50℃～65℃。在一些实施例中，所述蒸发光散射的漂移管温度为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些实施例中，所述蒸发光散射的漂移管温度为所述蒸发光散射的漂移管温度为60℃。

39、在一些实施例中，所述蒸发光散射的增益值为1～10。在一些实施例中，所述蒸发光散射的增益值为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施例中，所述蒸发光散射的增益值为6。

40、在一些实施例中，所述鉴别冬虫夏草粉原料规格等级的方法还包括检测前供试品溶液的制备：取冬虫夏草粉与水混合，回流提取，放冷至室温，离心，取上清液，将上清液与无水乙醇或乙醇水溶液混合，低温(例如1℃～10℃或2℃～8℃)放置，离心后取沉淀物挥发除去乙醇，加水混合，得到冬虫夏草多糖提取液；取适量冬虫夏草多糖提取液，采用sevage法除去蛋白，过滤，得到所述供试品溶液。

41、所述回流提取包括采用沸水浴回流提取。

42、在一些实施例中，所述低温放置的时间为10小时～18小时。在一些实施例中，所述低温放置的时间为10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时或18小时。

43、在一些实施例中，所述sevage法包括：将冬虫夏草多糖提取液与sevage溶液混合，剧烈震荡，静置，得上清液；取所述上清液用sevage溶液重复除蛋白，直至静置后无沉淀物产生。

44、在一些实施例中，所述sevage溶液为体积比为2:1～6:1的氯仿和正丁醇的混合液。在一些实施例中，所述sevage溶液为体积比为4:1的氯仿和正丁醇的混合液。

45、在一些实施例中，所述鉴别冬虫夏草粉原料规格等级的方法还包括采用对照品溶液进行检测。

46、在一些实施例中，所述方法包括采用对照品溶液进行检测后绘制标准曲线。

47、在一些实施例中，所述对照品溶液中的对照品为葡聚糖对照品。

48、在一些实施例中，所述葡聚糖对照品的分子量为1kda～670kda。

49、在一些实施例中，所述对照品溶液包括分别含分子量为1kda、12kda、80kda、150kda、410kda或670kda的葡聚糖对照品的水溶液。

50、在一些实施例中，所述对照品溶液中所述葡聚糖对照品的浓度为0.2mg/ml～1.0mg/ml。在一些实施例中，所述对照品溶液中所述葡聚糖对照品的浓度为0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml或1.0mg/ml。

51、在一些实施例中，所述鉴别冬虫夏草粉原料规格等级的方法，还包括采用对照品溶液进行检测，所述对照品溶液包括分别含0.5mg/ml分子量为1kda、12kda、80kda、150kda、410kda或670kda的葡聚糖对照品的水溶液。

52、有益效果

53、相比现有技术，本发明具有以下有益效果：

54、本发明通过制备冬虫夏草的多糖提取液，测定重均分子量为5×105da＜mw＜3×106da的多糖组分在冬虫夏草粉中的含量，判定冬虫夏草粉的原料规格等级。本发明结果为冬虫夏草粉的原料规格等级鉴别提供了方法，有利于维护消费者的利益。

55、术语说明

56、在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

57、术语“室温”表示环境温度，指温度在大约10℃至大约30℃，或大约20℃至30℃，或大约25℃。

58、在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

59、术语“v:v”表示体积比。

60、术语“kda”表示千道尔顿，为重均分子量的单位。术语“da”表示道尔顿，为重均分子量的单位。

61、术语“mw”表示重均分子量。

62、术语“g/100g”表示质量分数，例如“多糖组分2在冬虫夏草粉中含量为3.29g/100g”表示在100g冬虫夏草粉中含有3.29g多糖组分2。

63、在下面的内容中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％、15％或20％等差异。每当公开一个具有n值的数字时，任何具有n+/-1％,n+/-2％,n+/-3％,n+/-5％,n+/-7％,n+/-8％,n+/-10％,n+/-15％or n+/-20％值的数字会被明确地公开,其中“+/-”是指加或减。

技术特征：

1.一种鉴别冬虫夏草粉原料规格等级的方法，其包括：取冬虫夏草粉，检测特定多糖组分含量，从而鉴别冬虫夏草粉的原料规格等级。

2.根据权利要求1所述的方法，所述特定多糖组分的重均分子量为5×105da＜mw＜3×106da；和/或

3.根据权利要求1–2任一项所述的方法，所述小规格的冬虫夏草为每条重量≤0.25g的冬虫夏草；或者所述小规格的冬虫夏草为0.15g/条～0.25g/条的冬虫夏草或者所述小规格的冬虫夏草为每千克冬虫夏草的条数不少于4800条的冬虫夏草；和/或

4.根据权利要求1–3任一项所述的方法，其包括采用硫酸-苯酚法测定总多糖含量；和/或

5.根据权利要求1–4任一项所述的方法，所述高效液相色谱法采用凝胶色谱柱作为色谱柱；和/或

6.根据权利要求1–4任一项所述的方法，所述高效液相色谱法采用凝胶色谱柱作为色谱柱；和/或

7.根据权利要求5–6任一项所述的方法，所述凝胶色谱柱为tsk gel super multiporepw-h；和/或

8.根据权利要求1–7任一项所述的方法，其特征在于，还包括检测前供试品溶液的制备：取冬虫夏草粉与水混合，回流提取，放冷至室温，离心，取上清液，将上清液与无水乙醇或乙醇水溶液混合，低温放置，离心后取沉淀物挥发除去乙醇，加水混合，得到冬虫夏草多糖提取液；取适量冬虫夏草多糖提取液，采用sevage法除去蛋白，过滤，得到所述供试品溶液。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述回流提取包括采用沸水浴回流提取；和/或

10.根据权利要求1–9任一项所述的方法，其特征在于，还包括采用对照品溶液进行检测；和/或

技术总结
本发明提供一种鉴别冬虫夏草粉原料规格等级的方法，属于中药材检测技术领域。所述方法包括取冬虫夏草粉，检测特定多糖组分含量，从而鉴别冬虫夏草粉的原料规格等级。所述方法通过测定重均分子量为5×105Da＜MW＜3×106Da的多糖组分在冬虫夏草粉中的含量，判定冬虫夏草粉的原料规格等级。本发明结果为冬虫夏草粉的原料规格等级鉴别提供了方法，有利于维护消费者的利益。

技术研发人员：钱正明,周妙霞,李文庆,周建桥,闵文毕,黄琦
受保护的技术使用者：东莞市东阳光冬虫夏草研发有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5