一种基于FAA固定的植物时空转录组样本制备方法及应用与流程

本发明属于生物。更具体地，涉及一种基于faa固定的植物时空转录组样本制备方法及应用。

背景技术：

1、时空转录组作为2020年nature methods年度技术，是一种致力于将空间位置对应的转录信息量化的技术，近年来被大量科学杂志先后报道了该技术在不同领域重大突破和发现。它将在传统的转录组测序基础上带来详细的空间信息，帮助研究者辨别组织内部转录的位置，精确到细胞级别甚至更高的分辨率，这将促进研究者们对单个细胞和整个组织内细胞群体的认识和解读。

2、无数具有不同功能类型的细胞数量与发育(时间)和区域(空间)差异相结合，构成了生物组织转录异质性的主要组成部分。空间异质性是器官功能的关键特征，细胞的位置信息对细胞命运调控机制和细胞谱系发生过程的研究十分重要。因此，为了更好地了解细胞，有必要同时记录其转录异质性和空间坐标。目前，时空转录组技术通过测序的方式将带空间位置信息的探针以纳米级分辨率加载到生物芯片上，这些生物芯片对生物组织中的目标核酸或蛋白进行捕获，随后通过生化反应将捕获的信息转换成与之有对应关系的核苷酸序列并回收，最后通过二代测序将捕获信息和空间坐标一一对应。

3、而阻碍当前时空转录组技术的主要挑战是时空测序结果容易产生严重的信号扩散问题，造成信号扩散的原因为：基于原位杂交技术，利用纳米球探针捕获组织切片中的rna序列，其中rna序列要通过组织透化过程释放到反应溶液中，才可被探针捕获，在这个过程中由于分子热运动，透化得到的rna序列有可能在被原位探针结合之前就扩散到别的地方，导致组织扩散；还可能基于样本本身特性，例如细胞壁的厚度，细胞衰老程度，都会影响其透化过程，导致信号扩散的结果。因此，在植物领域中，由于植物组织特性，难以同时获得高质量切片和转录组文库，具有局限。而对于一些植物组织来说，信号扩散的问题尤其突出，并难以解决，会直接影响时空转录组结果。

4、现有时空转录组样本制备方法主要为冷冻包埋，即新鲜样本不经过任何处理直接用包埋剂在低温条件下进行快速冷冻包埋。鲜样直接包埋是比较推荐的，可避免其他操作过程中产生降解。但是，广泛使用的的简单冷冻包埋对大多数植物样本并不友好，因为植物样本存在液泡等结构，含水量一般大于动物组织，在冷冻包埋的过程中容易产生冰晶而使切片破损，无法获得好的切片效果，并且存在内部破损的组织在时空转录组切片在实验过程中很容易产生信号弥散。存在对样本进行包埋前预处理以减少切片破损的样本制备方法，常见有脱水处理，例如低浓度蔗糖、甘油梯度脱水处理，可一定程度减少切片破损，但其效果有限，并且对于组织信号扩散问题没有帮助。另外，时空转录组技术的样本制备也常采用石蜡包埋，即用常规石蜡包埋方案获得石蜡切片进行时空转录组实验，石蜡切片的优点在于切片完整，细胞结构清晰。但石蜡包埋的切片在时空测序芯片上的粘附性极差，很容易发生位移，并且经过长时间固定的组织往往存在rna被固定难以释放的情况，结果rna丰度低，从而不能获得质量好的数据；且石蜡包埋方案操作繁琐，用时长。况且，采用其他方法处理样本也存在固定的风险，难以释放rna，不利于时空转录组测序。

5、因此，为了解决现有时空转录组样本制备中采用直接冷冻方案存在信号扩散问题，容易破损，细胞结构不完整；采用石蜡包埋方案的时空样本rna难以释放，结果文库质量差，在时空芯片的粘附性差，容易发生组织位移，且石蜡包埋操作复杂，用时长等问题，有必要研发出更多新的制备或样本处理方法，使存在信号扩散问题的疑难样本的相关研究得以开展，来拓宽时空转录组技术的应用范围。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种基于faa固定的植物时空转录组样本制备方法及应用。

2、本发明的目的是提供一种基于faa固定的植物时空转录组样本制备方法。

3、本发明另一目的是提供所述基于faa固定的植物时空转录组样本制备方法的应用。

4、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

5、本发明一种基于faa固定的植物时空转录组样本制备方法，先采用faa固定液进行短时固定，再进行冷冻包埋，切片，固定，解交联，透化，制备植物时空转录组样本。

6、本发明采用的faa固定液为福尔马林-醋酸-酒精固定液，由50％或70％酒精90ml+冰醋酸5ml+福尔马林(37％～40％甲醛)5ml组成。faa的配方和具体浸泡时间都可根据样本组织特性进行调整，本发明采用的faa固定液配方为：福尔马林(38％甲醛)5ml、冰醋酸5ml、70％酒精90ml、5ml甘油(丙三醇)。

7、基于直接冷冻包埋切片容易破损，石蜡包埋的方案存在脱片，rna难以释放的缺点，且操作复杂，用时长，以及时空测序结果容易产生严重的信号扩散问题，本发明采用特定固定液预处理样本再进行包埋的方案来解决上述问题。本发明采用faa固定进行短时固定后再进行冷冻包埋，结合透化前结交联，就可以获得完整的切片，不影响rna释放的，获得了高质量的时空转录组数据，成功解决了信号扩散的问题，切片质量也对比直接冷冻包埋有了提升。

8、优选地，所述短时固定为固定10～30min。

9、优选地，所述解交联条件为：在50～70℃，采用tris-edta缓冲液处理1～2h。

10、本发明提供的方法具体含有以下步骤：

11、s1.选取植物样本；

12、s2.采用faa固定液浸泡植物样本，抽真空促进渗透，进行短时固定；

13、s3.将固定样本进行冷冻包埋，真空抽滤，去除气泡，调整材料位置，于-80℃保存；

14、s4.采用步骤s3包埋样品进行组织切片、染色、解交联、透化，即得植物时空转录组样本。

15、优选地，步骤s1中选取新鲜、完整的植物样本。

16、优选地，步骤s1中所述faa固定液含：38％甲醛水溶液、冰醋酸、70％酒精、甘油。

17、优选地，所述faa固定液中38％甲醛水溶液、冰醋酸、70％酒精、甘油的体积比为5:5:90:5。

18、优选地，步骤s2、s3中真空条件为0-0.08mpa，0-10min。

19、优选地，解交联条件为：在55℃下，采用tris-edta缓冲液浸泡处理1h。

20、本发明提供上述制备方法制备得到的样本在植物时空转录组测序中的应用。

21、本发明具有以下有益效果：

22、本发明提供一种基于faa固定的植物时空转录组样本制备方法，采用faa固定后直接冷冻包埋，再结合透化前结交联；进行短时间的固定，然后直接冷冻包埋，获得的切片完整且不影响rna释放的，能够获得高质量的时空转录组数据，成功解决了信号扩散问题，切片质量也对比直接冷冻包埋有了提升。本发明提供的制备方法对于容易产生信号扩散的时空转录组样本有很好的应用，并在多种植物样本都有很好的效果，可以很好的应用到植物时空转录组实验中，具有稳定性。

23、本发明基于faa固定和冷冻包埋，操作简单快捷，可帮助实验者获得高质量的植物时空转录组数据。针对常见的直接冷冻包埋和石蜡包埋方案的缺点，本发明的优点如下：

24、(1)本发明采用faa对rna进行短时固定，从而使rna锁定在原位，在后续rna释放过程中可被原位捕获，减少了信号扩散情况的出现；

25、(2)由于本发明采用了包埋前先用faa进行预处理样本，能够保存组织内细胞的形态、结构及其组成，从而提高了切片质量；

26、(3)faa浸泡固定，辅以rna释放前结交联，可使大部分rna成功释放，并被原位捕获，不存在石蜡包埋切片的rna难以释放的问题，本方案获得的结果rna表达丰度较高；

27、(4)石蜡包埋操作复杂，用时长，本发明对比石蜡包埋操作更加简单，用时更短。

技术特征：

1.一种基于faa固定的植物时空转录组样本制备方法，其特征在于，先采用faa固定液对植物样本进行短时固定，再进行冷冻包埋，切片，固定，解交联，透化，制备得到植物时空转录组样本。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述短时固定为固定10～30min。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述解交联条件为：在50～70℃，采用tris-edta缓冲液处理1～2h。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，具体含有以下步骤：

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤s1中选取新鲜、完整的植物样本。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤s1中所述faa固定液含：38％甲醛水溶液、冰醋酸、70％酒精、甘油。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述faa固定液中38％甲醛水溶液、冰醋酸、70％酒精、甘油的体积比为5:5:90:5。

8.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤s2、s3中真空条件为0-0.08mpa，5-10min。

9.根据权利要求4所述方法，其特征在于，解交联条件为：在55℃下，采用tris-edta缓冲液浸泡处理1h。

10.权利要求1～9任一所述制备方法制备得到的样本在植物时空转录组测序中的应用。

技术总结
本发明提供一种基于FAA固定的植物时空转录组样本制备方法及应用，采用FAA固定后再进行冷冻包埋，切片，固定，解交联，透化来制备植物时空转录组样本；本发明先进行短时间的固定，然后直接冷冻包埋，就可以获得切片完整的，不影响RNA释放的，能够获得高质量的时空转录组数据，成功解决了信号扩散问题，切片质量也对比直接冷冻包埋有了显著提升。本发明提供的方法能够用于容易产生信号扩散的时空转录组的多种植物样本，可以很好的应用到植物时空转录组测序中，具有很好的稳定性，对于存在信号扩散问题的植物时空转录组样本有重要意义。

技术研发人员：邵雯雯,郭兴,陈丽华,刘欢
受保护的技术使用者：深圳华大生命科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5