耳蜗支持细胞基因治疗和再生的方法与流程

本发明涉及基因工程技术，具体涉及耳蜗支持细胞基因治疗和再生的方法。

背景技术：

1、听力损失是影响全球残疾人寿命的第四大主要因素，影响着全球6％至8％的人口，严重降低人们的生活质量。近年来，治疗听力损失的努力越来越集中在基因治疗上，其可能作为一种治疗听力损失的解决方案。一些耳聋基因在耳蜗支持细胞(sc)中表达，因此针对内耳sc的基因治疗是非常有必要的。比如流行病学研究表明，很大比例的遗传性耳聋病例(各民族中30-50％)是由单个基因gjb2的功能丧失突变引起的，该基因编码一种主要的耳蜗间隙连接蛋白(gj)连接蛋白26(cx26)，主要在sc中表达，因此，若能在sc中特异性重新表达该蛋白，有望恢复gjb2缺失引起的听力损失，这将为临床上治疗该遗传性耳聋提供理论基础。然而，针对sc的特异性基因治疗方法仍然很少。有必要寻找新的针对sc的基因治疗方法来治疗像gjb2缺失引起的遗传性感音神经性听力丧失。

2、但是，目前内耳基因治疗常用的促进耳蜗细胞中特定转基因的表达的载体通常具有广泛性，不能靶向特定细胞类型。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了含有耳蜗支持细胞sc启动子区域的多核苷酸，以及含有该区域的载体，可用于促进耳蜗支持细胞sc中特定转基因的表达。

2、本发明提供一种耳蜗支持细胞特异性增强子，其包含seq id no:2所示的序列或与其有至少90％序列相同性并保留seq id no:2的功能的同源序列。所述同源序列是哺乳动物、优选灵长目、更优选人科的序列。

3、本发明还提供一种耳蜗支持细胞特异性启动子，其包含：

4、(1)seq id no:2所示的序列或与其有至少90％序列相同性并保留seq id no:2的功能的序列，和

5、(2)核心启动子元件。

6、在一个或多个实施方案中，(2)所述核心启动子元件是适于在哺乳动物细胞中启动基因表达的启动子。

7、在一个或多个实施方案中，(2)所述核心启动子元件是shh基因的启动子。

8、在一个或多个实施方案中，(2)所述核心启动子元件的序列如seq id no:3或与其有至少90％序列相同性的同源序列所示。所述同源序列是哺乳动物、优选灵长目、更优选人科的shh基因启动子序列。

9、本发明还提供一种核酸构建物，包含本文任一实施方案所述的耳蜗支持细胞特异性启动子。

10、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物还包含感兴趣的基因，所述基因与所述耳蜗支持细胞特异性启动子操作性连接。

11、在一个或多个实施方案中，所述基因选自：耳聋基因、转录因子基因、信号通路基因、对耳蜗支持细胞的基因进行操作或者在耳蜗支持细胞表达的工具基因。

12、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物还包含多克隆位点和/或终止子。优选地，所述终止子是polya终止子。

13、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是载体，例如克隆载体、整合载体、表达载体。在一个或多个实施方案中，所述载体是aav载体。

14、本发明还提供一种raav载体系统，包含aav载体和编码aav病毒所需基因的核酸构建物，所述aav载体包含本文任一实施方案所述耳蜗支持细胞特异性启动子。

15、在一个或多个实施方案中，所述aav载体还包含感兴趣的基因，所述基因与所述耳蜗支持细胞特异性启动子操作性连接。

16、在一个或多个实施方案中，aav病毒所需基因包括选自以下的一种或多种：rep、cap、e2a、e4和va基因。

17、本发明还提供一种raav病毒颗粒，包含本文任一实施方案所述耳蜗支持细胞特异性启动子。

18、本发明还提供一种宿主细胞，包含或基因组中整合有：本文任一实施方案所述耳蜗支持细胞特异性启动子、核酸构建物或aav载体系统。

19、本发明还提供一种药物组合物，包含药学上可接受的辅料，和选自以下的一种或多种：本文任一实施方案所述耳蜗支持细胞特异性启动子、核酸构建物、raav载体系统、raav病毒颗粒、宿主细胞。

20、本发明还提供一种在耳蜗支持细胞中表达基因的体外方法，包括将包含所述基因的核酸构建物导入耳蜗支持细胞的步骤，所述基因与本文任一实施方案所述的耳蜗支持细胞特异性启动子操作性连接。

21、在一个或多个实施方案中，所述基因选自：耳聋基因、转录因子、信号通路基因、对耳蜗支持细胞的基因进行操作或者在耳蜗支持细胞表达的工具基因。耳聋基因是耳蜗支持细胞表达的耳聋基因，包括gjb2、gjb3、gjb6、myh14、wfs1,eya4、tmprss3、dcdc2、gpsm2、kars。转录因子基因是与毛细胞再生相关的转录因子基因，包括atoh1、pou4f3、gfi1、ikzf2、insm1、six1。信号通路基因是与毛细胞再生相关的wnt、notch、hippo、tgf-beta信号通路中的基因。

22、本发明还提供seq id no:2所示的序列或与其有至少90％序列相同性并保留seqid no:2的功能的序列在嵌合启动子中的应用。

23、本发明还提供一种制备嵌合启动子的方法，包括：将(1)seq id no:2所示的序列或与其有至少90％序列相同性并保留seq id no:2的功能的序列与(2)核心启动子元件可操作性连接。

24、本发明还提供本文任一实施方案所述的耳蜗支持细胞特异性启动子在制备用于治疗由耳蜗支持细胞中基因缺陷引起的疾病的药物中的应用，所述药物用于在耳蜗支持细胞中表达所述基因。

25、所述基因选自：耳聋基因、转录因子、信号通路基因、对耳蜗支持细胞的基因进行操作或者在耳蜗支持细胞表达的工具基因。耳聋基因是耳蜗支持细胞表达的耳聋基因，包括gjb2、gjb3、gjb6、myh14、wfs1,eya4、tmprss3、dcdc2、gpsm2、kars。转录因子基因是与毛细胞再生相关的转录因子基因，包括atoh1、pou4f3、gfi1、ikzf2、insm1、six1。信号通路基因是wnt、notch、hippo、tgf-beta信号通路中的基因。

26、在一个或多个实施方案中，所述疾病是由耳蜗支持细胞中基因缺陷引起的遗传性耳聋。优选地，所述疾病是由gjb2的功能缺失引起的遗传性耳聋。

27、本发明还提供一种治疗由耳蜗支持细胞中基因缺陷引起的疾病的方法，包括在耳蜗支持细胞中表达所述基因的步骤，所述基因与本文任一实施方案所述的耳蜗支持细胞特异性启动子操作性连接。

28、在一个或多个实施方案中，所述方法包括将包含所述基因的编码序列的核酸构建物或载体导入耳蜗支持细胞的步骤，所述基因的编码序列与所述耳蜗支持细胞特异性启动子操作性连接。

29、在一个或多个实施方案中，所述基因是耳蜗支持细胞表达的耳聋基因，包括gjb2、gjb3、gjb6、myh14、wfs1,eya4、tmprss3、dcdc2、gpsm2、kars。

30、在一个或多个实施方案中，所述疾病是由gjb2的功能缺失引起的遗传性耳聋。

31、本发明还提供一种诱导耳蜗支持细胞分化为毛细胞的方法，包括在耳蜗支持细胞中表达与毛细胞再生相关的转录因子基因和/或信号通路基因的步骤，所述基因与本文任一实施方案所述的耳蜗支持细胞特异性启动子操作性连接。所述方法是体外方法。

32、在一个或多个实施方案中，所述方法包括将包含所述转录因子和/或信号通路基因的编码序列的核酸构建物或载体导入耳蜗支持细胞的步骤，所述编码序列与所述耳蜗支持细胞特异性启动子操作性连接。

33、在一个或多个实施方案中，转录因子基因包括atoh1、pou4f3、gfi1、ikzf2、insm1、six1。

34、在一个或多个实施方案中，信号通路基因是与毛细胞再生相关的wnt、notch、hippo、tgf-beta信号通路中的基因。

35、本发明的有益效果：

36、通过在新生小鼠耳蜗中注射对照组病毒aav-ie-cag-nls-egfp和aav-ie-cag-nls-egfp-mgjb2后在第30天进行abr测听，实验组cag驱动gjb2在sc和毛细胞(hcs)区域表达后听力有损伤。说明广谱的启动子如cag等驱动的基因表达不适用于gjb2突变所致耳聋的基因治疗。

37、通过在新生小鼠耳蜗中注射病毒aav-sox47-mneongreen(sox47启动子序列:seqid no:1)后在第14天取耳蜗进行免疫荧光染色，发现绿色荧光蛋白mneongreen在sc中特异性表达。而且本发明的特异性sc的启动子对遗传性耳聋具有治疗效果。并且导入外源基因具有安全性，避免在毛细胞中过表达基因从而损伤毛细胞。

技术特征：

1.一种耳蜗支持细胞特异性增强子，其包含seq id no:2所示的序列或与其有至少90％序列相同性并保留seq id no:2的功能的同源序列，

2.一种耳蜗支持细胞特异性启动子，其包含：

3.一种核酸构建物，包含权利要求2所述的耳蜗支持细胞特异性启动子，

4.一种raav载体系统，包含aav载体和编码aav病毒所需基因的核酸构建物，所述aav载体包含权利要求2所述的耳蜗支持细胞特异性启动子，

5.一种raav病毒颗粒，包含权利要求2所述的耳蜗支持细胞特异性启动子。

6.一种宿主细胞，包含或基因组中整合有：权利要求2所述的耳蜗支持细胞特异性启动子、权利要求3所述的核酸构建物或权利要求4所述的aav载体系统。

7.一种药物组合物，包含药学上可接受的辅料，和选自以下的一种或多种：权利要求2所述的耳蜗支持细胞特异性启动子、权利要求3所述的核酸构建物或权利要求4所述的aav载体系统、权利要求5所述的raav病毒颗粒、权利要求6所述的宿主细胞。

8.一种在耳蜗支持细胞中表达基因的方法，包括将包含所述基因的核酸构建物导入耳蜗支持细胞的步骤，所述基因与权利要求2所述的耳蜗支持细胞特异性启动子操作性连接。

9.seq id no:2所示的序列或与其有至少90％序列相同性并保留seq id no:2的功能的同源序列在嵌合启动子中的应用。

10.一种制备嵌合启动子的方法，包括：将(1)seq id no:2所示的序列或与其有至少90％序列相同性并保留seq id no:2的功能的序列与(2)核心启动子元件可操作性连接。

11.权利要求2所述的耳蜗支持细胞特异性启动子在制备用于治疗由耳蜗支持细胞中基因缺陷引起的疾病的药物中的应用，所述药物用于在耳蜗支持细胞中表达所述基因，

12.一种诱导耳蜗支持细胞分化为毛细胞的方法，包括在耳蜗支持细胞中表达与毛细胞再生相关的转录因子和/或信号通路基因的步骤，所述基因与权利要求2所述的耳蜗支持细胞特异性启动子操作性连接，

技术总结
本发明涉及耳蜗支持细胞基因治疗和再生的方法，具体提供一种耳蜗支持细胞特异性启动子SEQ ID NO:1，其包含：(1)SEQ ID NO:2所示的增强子序列或与其有至少90％序列相同性并保留SEQ ID NO:2的功能的序列，和(2)核心启动子元件SEQ ID NO:3。所述启动子特异性在耳蜗支持细胞中驱动转基因的表达。

技术研发人员：柴人杰,崔志平,宋怀恩,张善中,孙思睫,张李燕,孙秋寒,齐洁玉,谈方志,谭畅,陆玲
受保护的技术使用者：苏州星奥拓维生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5