小分子抑制剂以及在抑制S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶上的应用

本发明属于生物医学领域，涉及一种s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(adometdc)的小分子抑制剂及其应用；具体涉及人源s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的小分子抑制剂及其在抑制和杀伤肿瘤细胞中的应用。

背景技术：

1、蛋白质是一切生命的物质基础，是机体细胞的重要组成部分。酶作为蛋白质的一种重要存在形式，在生命活动中发挥着重要作用。酶对于底物具有高度的特异性和催化效能，几乎调控着生物体内所有的生化反应过程。酶的活性在生物体内受到严格的调控，一旦其调控机制出现问题，造成酶活过高、过低或者是完全失活，都会引发相应疾病的出现。因此，通过药物来调控酶活，使其恢复和保持在正常水平，具有非常重要的理论意义和现实意义。以结构为基础的药物设计，是蛋白质靶标药物发现的一个重要手段。

2、多胺是聚阳离子烷基胺，包括腐胺，亚精胺和精胺，以毫摩尔浓度存在于哺乳动物细胞中。多胺代谢与许多基本的细胞过程密切相关，例如分化、凋亡、核酸合成、转录、翻译、自噬和免受氧化应激的影响等。在正常的生理条件下，细胞内多胺的浓度通过生物合成酶和分解代谢酶的动态网络以及运输系统严格调节，这种精确的调节确保细胞内多胺的浓度保持在严格控制的范围内。研究发现，肿瘤快速生长依赖于细胞内较高的多胺水平，因此肿瘤中多胺的代谢以及对多胺的需求经常失调，包括乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌和皮肤癌等。在肿瘤细胞中，多胺直接参与多种致癌和细胞信号通路，数据表明多胺途径与许多癌基因有关，如下游靶标myc和ras，因此特别是癌基因驱动的癌症，癌细胞中生长控制的丧失使转化细胞比正常细胞对多胺消耗更敏感，多胺代谢途径已经是化学预防和化学治疗的合理靶标。近年来，已经探索了许多多胺生物合成抑制剂作为癌症治疗剂，利用多胺代谢途径作为癌症治疗和预防策略的潜力逐步增加，通过改变多胺途径中限速酶的调控是应对各种类型癌症的一种策略。

3、作为多胺途径的限速酶，s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(adometdc)是一种丙酮酰脱羧酶，adometdc催化s-腺苷甲硫氨酸(adomet)转化为脱羧的s-腺苷甲硫氨酸(dcadomet)，同时产生二氧化碳，脱羧的s-腺苷甲硫氨酸将氨丙基转移至亚精胺合成酶和精胺合成酶，腐胺和亚精胺分别在亚精胺合成酶和精胺合成酶催化下形成亚精胺和精胺，并且完全致力于多胺的生物合成。因此，adometdc的表达和活性与多胺的细胞浓度密切相关。此外，s-腺苷甲硫氨酸还是许多甲基转移反应(例如组蛋白和dna甲基化过程)的甲基来源，甲基转移活性与s-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶有关，adometdc酶活性的变化会使s-腺苷甲硫氨酸参与甲基转移的功能受到影响。在多种类型的癌症和寄生虫病中，多胺生物合成机制被上调，而s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶作为多胺途径的限速酶，其抑制剂已成为有吸引力的癌症药物靶标。

4、adometdc的抑制剂甲基乙二醛双脒基腙(mgbg)是亚精胺的结构类似物，已证明可竞争性抑制adometdc并降低亚精胺和精胺的细胞内水平，同时增加腐胺的水平。mgbg也是首个在临床前和临床研究中广泛研究的adometdc抑制剂，在临床研究中，mgbg被证明可有效治疗多种恶性疾病，包括急性白血病，淋巴瘤和多发性骨髓瘤。但是mgbg处理所显示的线粒体毒性先于其对多胺的作用，因此非常有必要开发出具有更好效果的adometdc新型抑制剂。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种针对adometdc的新型小分子抑制剂，将其应用于s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的抑制剂，可能可以用作制备治疗肿瘤、病原微生物感染的药物。

2、本发明提供的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供小分子抑制剂在制备抑制s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶药物的应用，该小分子的结构如下：

4、

5、

6、其中，r为nh2-nh-。

7、进一步，所述的adometdc蛋白为人源adometdc蛋白。

8、进一步，在反应终体积内小分子抑制剂的用量摩尔浓度比范围为小分子抑制剂：蛋白＝3:1～100:1。优选的，在反应终体积内小分子抑制剂的用量摩尔浓度比范围为小分子抑制剂：蛋白＝50:1～100:1。

9、第二方面，本发明提供将上述小分子用于抑制s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的方法，具体步骤如下：

10、1、adometdc原核基因质粒的构建

11、将adometdc基因序列通过ncoⅰ和xxoⅰ酶切位点，插入到pet28a质粒中，构建得到pet28a-his-adometdc质粒，经dna测序验证；

12、2、adometdc蛋白的表达

13、将步骤1构建的pfet28a-his-adometdc质粒通过cacl2法，转化到大肠杆菌bl21菌株中，通过氨苄青霉素进行筛选，然后将在含有氨苄青霉素的luria-bertani(lb)培养板上生长的菌株，接种至含有氨苄青霉素的lb液体培养基中进行培养，最后，离心收集细菌；

14、3、adometdc蛋白的纯化

15、将步骤2中所收集的菌泥，用裂解缓冲液进行重悬，用超声方法进行裂解，再将裂解液离心，保留上清；最后利用ni-ntahis标签蛋白结合填料进行结合和纯化，得到adometdc蛋白；

16、4、adometdc蛋白的活性测试

17、将adometdc、up h2o按每组两个平行加入孔板的b排混匀后，再加入二氧化碳测定试剂r2；之后在a排中加入up h2o、adomet、二氧化碳测定试剂r1。恒温箱孵育，然后用排枪吹打均匀后从a孔中吸取加入b孔，连续检测活性。

18、5、抑制剂对adometdc蛋白的抑制活性的检测

19、首先，往ep管中加入adometdc、up h2o、dmso或小分子混匀后，恒温孵育，然后按每组两个平行在孔板的b排分装，再加入二氧化碳测定试剂r2；之后在a排中加入up h2o、adomet、二氧化碳测定试剂r1。恒温箱孵育，然后用排枪吹打均匀后从a孔中吸取加入b孔，连续检测活性。

20、通过以下公式计算出adometdc抑制率：

21、对照差＝未加小分子抑制剂组检测过程中的od最高值-未加小分子抑制剂组5min时od值；

22、实验差＝加小分子抑制剂组检测过程中的od最高值-加小分子抑制剂组5min时od值；adometdc抑制率＝[(对照差-实验差)/对照差]×100％；

23、6、maldi-tof共价结合验证

24、将adometdc蛋白和小分子在孵育缓冲液中孵育一定时间；各取sa和样品点在金属板上，待完全挥发后放进仪器进行检测。

25、7、cck-8法检测不同浓度小分子对t47d细胞的杀伤效果

26、取对数生长期的t47d细胞，标准消化处理后制成细胞悬液，细胞计数后得到细胞悬液的浓度，以一定密度接种于孔板中，置于37℃含co2培养箱中过夜贴壁培养。次日弃去每孔中旧培养基，用含不同小分子的培养基处理细胞，然后置于培养箱中孵育。药物孵育完成后，吸出旧培养基，然后在每个实验孔中加入含cck-8的培养基。置于培养箱中继续孵育，然后用酶标检测仪检测每孔的吸光值(od值)。

27、通过以下公式计算t47d的细胞存活率：

28、计算细胞存活率(％)＝(od加药-od空白)/(od对照-od空白)×100％

29、进一步，步骤3中所述的裂解缓冲液为：20mm na2hpo4·12h2o，500mm nacl，30mm咪唑(imidazole)，2.5mm put，ph 7.0。

30、进一步，步骤6中所述的孵育缓冲液为：100mm nacl，20mm na2hpo4，ph 7.0。

31、按照上述方案，将潜在具有抑制活性的小分子进行实验筛选。

32、本发明的有益效果如下：

33、本发明提供一种小分子抑制剂，该抑制剂对于adometdc表现出良好的抑制效果，可用于制备adometdc抑制剂和组合药物，以治疗相关的疾病，如急性白血病，淋巴瘤和多发性骨髓瘤等，具有较大的应用前景。

技术特征：

1.小分子抑制剂在制备抑制s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶药物的应用，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的小分子抑制剂在制备抑制s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶药物的应用，其特征在于：所述s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶为人源s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶。

3.根据权利要求1所述的小分子抑制剂在制备抑制s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶药物的应用，其特征在于：在反应终体积内小分子抑制剂的用量摩尔浓度比范围为小分子抑制剂：蛋白＝3:1～100:1。

技术总结
本发明公开了一种S‑腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AdoMetDC)的小分子抑制剂及其应用。本发明提供的针对S‑腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AdoMetDC)的新型小分子抑制剂，经验证发现其对AdoMetDC具有良好的抑制作用，尤其可用于抑制人源AdoMetDC，在预防和治疗肿瘤疾病、病原微生物感染，以及研发制备肿瘤药物或病原微生物感染类药物等领域具有较大的应用潜力。

技术研发人员：刘森,刘昭祥,张岩
受保护的技术使用者：湖北工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5