一种具有群体感应自诱导系统的谷氨酸棒状杆菌及构建方法和应用与流程
本发明涉及一种具有群体感应自诱导系统的谷氨酸棒状杆菌及构建方法和应用，属于生物发酵。
背景技术：
1、丁二酸又称琥珀酸，其重要用途之一为制备五元杂环化合物，且其脱水生成的琥珀酸苷是制备药物、染料和醇酸树脂的重要原料，同时，丁二酸在医药上有抗痉挛、祛痰和利尿作用，还可以应用于食品调味领域，正因为其应用广泛，所以每年全球对其需求量巨大。
2、群体感应自诱导系统(comqxpa-psrfa)是一种通过细胞密度增加来实现对目的基因表达调控的系统，不需要额外添加诱导剂。comqxpa操纵子由comx、comq、comp和coma，4个基因组成，其中comx编码前导肽(pre-comx)，该前导肽再经comq基因的编码产物异戊二烯转移酶comq的修饰处理，产生多肽信息素comx。随着细菌的生长和群体密度的增加，释放到胞外的信息素分子comx不断积累。当达到一定阈值时，信息素comx就与跨膜蛋白组氨酸激酶comp结合，并激活该酶，促进其发生自磷酸化。磷酸化的comp随后将磷酸基团转移给coma调控蛋白，并激活该蛋白。被激活的coma蛋白进而结合在下游靶基因的启动子上并激活下游靶基因的表达，启动子psrfa是comqxpa操纵子的靶启动子。
3、目前市场中绝大部分的丁二酸为石化法制得，主要过程为顺丁烯二酸酐或反丁烯二酸在催化剂作用下加氢反应制得丁二酸，然而石油资源紧缺，环境污染巨大，所以急需一种绿色的可替代的丁二酸制备方法。
4、微生物合成法采用碳水化合物这种可再生原料作为初始碳源，该方法具有低成本，对环境友好，可再生等优点。并且，微生物合成丁二酸的过程中还会吸收二氧化碳，可以有效促进低碳经济的实现。丁二酸生物制造技术的核心就是研发将生物质原料高效转化为丁二酸的微生物菌株。
5、谷氨酸棒状杆菌发酵制备丁二酸具有成本低廉、利用可再生的农业资源包括二氧化碳作为原料，避免对石化原料的依赖，保证了稳定的价格、减少了对环境的污染的优势。但是现有技术中，谷氨酸棒状杆菌发酵制备丁二酸产率低，规模化生产成本高的问题亟待解决。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明提供了一种用于生产丁二酸的具有群体感应自诱导系统的谷氨酸棒状杆菌及构建方法和应用，发酵制备丁二酸时产率高，规模化生产成本低，具有广阔的应用前景。
2、第一方面，本发明提供一种用于生产丁二酸的具有群体感应自诱导系统的谷氨酸棒状杆菌，所述谷氨酸棒状杆菌异源表达了群体感应自诱导系统comqxpa-psrfa，还过表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck和/或丙酮酸羧化酶编码基因pyc；其中，所述群体感应自诱导系统comqxpa-psrfa包括操纵子comqxpa和启动子psrfa。
3、本发明所述用于生产丁二酸的具有群体感应自诱导系统的谷氨酸棒状杆菌含有群体感应自诱导系统，该系统可以保证丁二酸合成时，菌液活菌数适中，在进入无氧环境时，菌株即开启丁二酸的合成，随着丁二酸浓度的增加，菌株面临生长与代谢的双重胁迫，当引入群体感应自诱导系统后，当菌株活菌数下降到一定数量时，菌株会关闭部分丁二酸合成的代谢途径，此时菌株代谢合成丁二酸的压力减少，当菌落重新生长到一定数量时，代谢重新开启，即引入该系统谷氨酸棒状杆菌在无氧发酵合成丁二酸时受到的胁迫更小，含有该系统的菌株的发酵终od600更高。结果显示，含有群体感应自诱导系统和丙酮酸羧化酶编码基因pyc的菌株，较单独含丙酮酸羧化酶编码基因pyc的菌株的产量高。
4、此外本发明还发现强化表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck或丙酮酸羧化酶编码基因pyc，均可使丁二酸产量提高，并且当两个基因同时强化时，丁二酸产量升高最为显著，可达出发菌株的22.9％。因此，pck和pyc两个基因同时强化表达在提高丁二酸产量方面具有意想不到的协同增效作用。
5、在强化表达pck和pyc的菌株中，导入comqxpa-psrfa还可进一步提高丁二酸产量，该菌株摇瓶生产中产量即达到118.9g/l，产量较出发菌株提高了40.9％。
6、进一步地，操纵子comqxpa的核苷酸序列如seq id no.1所示，启动子psrfa的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7、进一步地，启动子psrfa是comqxpa操纵子的靶启动子，comqxpa操纵子受到菌体浓度影响，可以控制启动子psrfa的开启和关闭，从而控制受psrfa调控的下游基因的表达。本发明中，pyc和/或pck位于启动子psrfa的下游。
8、进一步地，丙酮酸羧化酶编码基因pyc受群体感应自诱导系统comqxpa-psrfa的调控。
9、进一步地，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck的核苷酸序列如seq idno.3所示。
10、进一步地，丙酮酸羧化酶pyc在如seq id no.4所示氨基酸序列的基础上将第458位脯氨酸突变为丝氨酸得到。
11、进一步地，所述丙酮酸羧化酶编码基因pyc的核苷酸序列如seq id no.5所示。
12、进一步地，本发明所述用于生产丁二酸的具有群体感应自诱导系统的谷氨酸棒状杆菌以谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc 13032为出发菌株。
13、进一步地，所述群体感应自诱导系统comqxpa-psrfa、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck或丙酮酸羧化酶编码基因pyc的表达载体包括peki表达载体。本发明所述基因表达载体可以选择本领域技术人员所熟知的用于谷氨酸棒状杆菌的任意表达载体。
14、第二方面，本发明提供一种生产丁二酸的具有群体感应自诱导系统的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：
15、s1、将磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck、丙酮酸羧化酶编码基因pyc连接至表达载体上，得到重组质粒ppyc或ppck-pyc；
16、s2、将群体感应自诱导系统comqxpa-psrfa连接至s1所述的重组质粒ppyc或ppck-pyc上，制得重组质粒pcomqxpa-psrfa-pyc或pcomqxpa-psrfa-pck-pyc；
17、s3、将s2所述重组质粒导入谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中，构建得到所述生产丁二酸的具有群体感应自诱导系统的谷氨酸棒状杆菌。
18、第三方面，本发明提供如第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌在生产丁二酸或含丁二酸的产品中的应用。
19、第四方面，本发明提供一种生产丁二酸的方法，采用第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌进行发酵合成丁二酸。
20、本发明所述的生产丁二酸的方法中应用第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌进行发酵生产，第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌发酵生产丁二酸产量高，产率高。因此，本发明所述生产丁二酸的方法操作简单，易于工业放大，且规模化生产成本低。
21、本发明的有益效果：
22、本发明提供了一种用于生产丁二酸的具有群体感应自诱导系统的谷氨酸棒状杆菌，通过引入合适的群体感应自诱导系统comqxpa-psrfa，并与pck和pyc产生协同作用，使丁二酸产量达到118.9g/l，相对于未引入群体感应自诱导系统，产量提高了约14.7％，相对于出发菌株产量提高了约40.9％。
技术特征：
1.一种具有群体感应自诱导系统的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述谷氨酸棒状杆菌过表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck和/或丙酮酸羧化酶编码基因pyc，此外还异源表达了群体感应自诱导系统comqxpa-psrfa。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述群体感应自诱导系统comqxpa-psrfa中，操纵子comqxpa的核苷酸序列如seq id no.1所示；启动子psrfa的序列如seq id no.2所示。
3.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述丙酮酸羧化酶编码基因pyc受群体感应自诱导系统comqxpa-psrfa的调控。
4.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck的核苷酸序列如seq id no.3所示。
5.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：丙酮酸羧化酶pyc在如seq idno.4所示氨基酸序列的基础上将第458位脯氨酸突变为丝氨酸得到。
6.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：以谷氨酸棒状杆菌atcc 13032为出发菌株。
7.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述群体感应自诱导系统comqxpa-psrfa、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck或丙酮酸羧化酶编码基因pyc的表达载体包括peki表达载体。
8.一种生产丁二酸的具有群体感应自诱导系统的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.权利要求1-7任一项所述的谷氨酸棒状杆菌在生产丁二酸或含丁二酸的产品中的应用。
10.一种生产丁二酸的方法，其特征在于：采用权利要求1-7任一项所述的谷氨酸棒状杆菌进行发酵合成丁二酸。
技术总结
本发明公开了一种具有群体感应自诱导系统的谷氨酸棒状杆菌及构建方法和应用，属于生物发酵技术领域。本发明首先通过强化表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck和/或丙酮酸羧化酶编码基因pyc使丁二酸产量提高了7.5％‑22.9％；此外，导入群体感应自诱导系统ComQXPA‑PsrfA用于调控丙酮酸羧化酶编码基因pyc的表达，与无群体感应自诱导系统调控的菌株相比，丁二酸产量进一步提高；而且，同时导入pck和受群体感应自诱导系统调控的pyc，丁二酸产量提高最为显著，摇瓶生产中产量即达到118.9g/L，产量较出发菌株提高了40.9％。因此，本发明为丁二酸的规模化、低成本生产奠定了基础。
技术研发人员：李承,姜睿康,薛怡芸,李振,张天元
受保护的技术使用者：苏州聚维元创生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5