小分子抑制剂以及在抑制脱氧羟腐胺赖氨酸合酶活性作用方面的应用

本发明属于生物医学领域，涉及一种针对蛋白活性作用的小分子抑制剂及其应用；具体涉及人源脱氧羟腐胺赖氨酸合酶(deoxyhypusine synthase，dhs)活性作用的小分子抑制剂的应用。

背景技术：

1、蛋白质是维持生物体正常生命活动不可或缺的一类主要物质，细胞内多种蛋白的协调作用促进了生物功能的正常发挥。但是某些基因的非正常表达，打乱了正常运行的胞内信号网络，影响了细胞的正常增殖，导致癌症的恶性进展。目前，针对癌症的治疗策略已经由化疗药逐渐转变为尽可能使用靶向药的策略。因此，针对癌症中过表达的蛋白进行功能抑制研究是药物开发的有效策略。

2、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌，都是高发恶性肿瘤疾病；研究表明，在这些癌症的恶性进展中，存在一种关键的蛋白——eif5a蛋白。eif5a蛋白是真核生物中的高度保守的一种蛋白，在大多数蛋白的翻译过程中发挥作用，eif5a的hypusine残基可以和trna受体臂相互作用，缓解多脯氨酸基序导致的翻译停滞。目前已经发现eif5a促进肿瘤细胞的上皮间充质转化，促进细胞侵袭和转移。eif5a发挥作用必须经过翻译后修饰，将lys50修饰为hpu50。

3、dhs是催化该翻译后修饰的第一个关键蛋白。dhs通过将亚精胺的丁胺基团转移到eif5a的lys50生成deoxyhypusine，然后在dohh的催化下残基最终被修饰为hypusine。dhs蛋白通过催化eif5a的翻译后修饰，导致成熟化eif5a的产生。成熟eif5a可以缓解原癌基因myc在表达过程中的核糖体停滞促进myc延伸，也可以正向反馈调节peak1、rhoa等癌症转移相关通路。

4、通过阻断eif5a的成熟化，可以达到抑制恶性肿瘤发展的目的，因此开展dhs酶活性抑制的研究是有意义的。目前带有高表达dhs和eif5a特点的神经母细胞瘤、结肠癌等癌症病人都存在预后不良及生存率低的特点，所以靶向dhs抑制eif5a成熟化是非常好的治疗策略。除此之外，临床上没有针对dhs的抑制剂。gc-7和cni-1493作为dhs的抑制剂在上个世纪被合成出来，但是一直没有应用于癌症治疗。因此针对dhs的小分子抑制剂目前仍然十分缺乏，所以针对该靶标进行药物开发有必要的。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明提供一种抑制dhs活性的新型小分子抑制剂，为临床上治疗相关疾病提供一种潜在的药物。

2、本发明提供的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供小分子抑制剂在制备抑制脱氧羟腐胺赖氨酸合酶活性作用的药物的应用。该小分子的结构如下：

4、

5、

6、进一步，所述dhs蛋白为人源dhs蛋白，eif5a翻译后修饰过程的关键蛋白。

7、进一步，在反应终体积内小分子抑制剂的用量摩尔浓度比范围为小分子抑制剂：蛋白＝50:1～100:1。优选的，在反应终体积内小分子抑制剂的用量摩尔浓度比范围为小分子抑制剂：蛋白＝80:1～100:1。

8、第二方面，本发明提供将第一方面所述小分子用于抑制dhs酶活性的方法，具体步骤如下：

9、1、dhs原核基因质粒的构建

10、将dhs基因序列通过bamhi和xhoⅰ酶切位点，插入到pet28a质粒中，构建得到pet28a-his-dhs质粒，经dna测序验证；

11、2、dhs融合蛋白的表达

12、将步骤1中所构建的质粒通过cacl2法，转化到大肠杆菌bl21菌株中，通过卡那霉素进行筛选，然后将在含有卡那霉素的luria-bertani(lb)培养平板上生长的单菌落，接种至含有卡那霉素的液体lb培养基中，培养至对数生长期，添加异丙基硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导，随后离心收集；

13、3、dhs融合蛋白的纯化

14、将步骤2中所收集的菌泥，用裂解缓冲液进行重悬，用超声方法进行裂解，再将裂解液在进行离心，保留上清；最后利用ni-nta his标签蛋白结合填料进行结合和纯化，得到人源dhs融合蛋白；

15、4、dhs蛋白的酶活性测试

16、孔板中每孔加入含有his-dhs蛋白和nad+的蛋白反应液，进行预热。同时准备含有不同梯度浓度的亚精胺(spd)的底物反应液加入孔板中，放入孵育箱预热。以上共两排样品，每个浓度两个复孔。预热完毕后，用排枪取底物反应液加入到蛋白反应液中，混匀后迅速进入酶标仪进行检测。

17、5、dmso和孵育时间对酶活性的影响

18、ep管中配制含有his-dhs蛋白和nad+的蛋白反应液，按照孵育90min、70min、50min、30min、10min、0min的顺序依次取出蛋白反应液进行孵育。准备含有亚精胺(spd)的底物反应液，放入孵育箱中预热。最后一个样品孵育完毕后，将6个样品加入a排，每个样品两个复孔。用排枪取底物反应液100μl加入到a排中，混匀后迅速进入酶标仪进行检测。

19、ep管中配置含有his-dhs蛋白和nad+的蛋白反应液，按照孵育90min、50min、10min的顺序备样，每个孵育时间准备两个样品，分别为蛋白反应液和蛋白反应液(0.2％ dmso)，两个样品同时放入37℃孵育箱。3个孵育时间共6个样品。准备含有亚精胺(spd)的底物反应液，放入孵育箱37℃预热5min。以上共两排样品，每个样品两个复孔。最后一组样品孵育完毕后，将6个样品加入96孔板a排。用排枪取底物反应液100μl加入到a排中，混匀后迅速进入酶标仪进行检测。

20、6、抑制剂活性验证

21、ep管中配置含有his-dhs蛋白和nad+的蛋白反应液。阴性对照组蛋白反应液加入dmso(0.2％)。实验组蛋白反应液加入小分子母液(dmso溶解为100mm)放入37℃孵育箱孵育10min。准备含有亚精胺(spd)的底物反应液，放入孵育箱37℃预热5min。以上共两排样品，每个样品两个复孔。孵育完毕后，用排枪取底物反应液加入到蛋白反应液排中，混匀后迅速进入酶标仪进行检测。

22、7、共价抑制活性验证

23、按照步骤6的体系进行实验，将蛋白与小分子的孵育时间改为50min、90min，呈时间梯度，最后将孵育10min、50min、90min的三组实验放在一起进行比较。

24、inhibition(％)＝(1-δrfu(分子)/δrfu(dmso))*100。

25、8、maldi-tof共价性验证

26、空白组：将his-dhs与dmso混合；

27、实验组：将his-dhs与小分子母液混合；

28、置于37℃下孵育1h；

29、用0.1％tfa对反应体系进行稀释，使his-dhs的最终浓度为0.4～1.0mg/ml；

30、取5μl稀释后的反应体系与5μl sa基质进行混合；

31、取1μl混合样点于金属靶板上，进行质谱；

32、用flex control软件采集数据和flex analysis软件处理数据；

33、步骤3中所述的裂解缓冲液为：50mm三羟甲基氨基甲烷(tris)/hcl，ph＝8.0，300mm nacl，300mm咪唑(imidazole)；

34、步骤4中的反应液成分为：ph＝7.4，137mm nacl，10mm na2hpo4，2mm kh2po4

35、步骤8中，0.1％(v/v)tfa为：5ml up h2o中加入5μl tfa；ta30为：300μl的乙腈与700μl的0.1％tfa混合；sa基质为：sa(芥子酸)的ta30的饱和溶液。

36、按照上述方案，将潜在具有抑制活性的小分子进行实验筛选。

37、本发明的有效效果如下：

38、本发明提供的抑制dhs活性的新型小分子抑制剂，经测试表明其具有良好的抑制dhs活性的效果。该抑制剂为临床治疗带有高表达dhs和eif5a特点的神经母细胞瘤、结肠癌等癌症提供一种靶向治疗策略，具有较大的应用前景，还可以扩展治疗手段。

技术特征：

1.小分子抑制剂在制备抑制脱氧羟腐胺赖氨酸合酶活性作用的药物的应用，其特征在于：该小分子结构如下：

2.根据权利要求1所述的小分子抑制剂在制备抑制脱氧羟腐胺赖氨酸合酶活性作用的药物的应用，其特征在于：所述脱氧羟腐胺赖氨酸合酶为人源脱氧羟腐胺赖氨酸合酶。

3.根据权利要求1所述的小分子抑制剂在制备抑制脱氧羟腐胺赖氨酸合酶活性作用的药物的应用，其特征在于：在反应终体积内小分子抑制剂的用量摩尔浓度比范围为小分子抑制剂：蛋白＝50:1～100:1。

技术总结
本发明公开了一种针对蛋白活性的小分子抑制剂及其应用。本发明通过实验筛选的方式，获得一种针对脱氧羟腐胺赖氨酸合酶(Deoxyhypusine Synthase，DHS)活性的新型小分子抑制剂，并通过后续的验证，发现其具有良好的抑制活性，为临床上治疗相关疾病提供一种潜在的药物。

技术研发人员：刘森,苗梦尧
受保护的技术使用者：湖北工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5