一种（-）-吉玛烯A的合成酶及其制备方法与流程

本发明属于生物，涉及一种(-)-吉玛烯a的合成酶及其制备方法。

背景技术：

1、β-榄香烯(β-elemene)是一种具有郁金香风味的挥发性倍半萜类化合物，口服乳和注射液药物作为国家二类新药在临床上已经取得了显著的疗效。

2、目前生物途径通过吉马烯a合酶(germacrenea synthase,gas)催化前体物质法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,fpp)生成倍半萜类化合物吉马烯a，吉马稀a在体外可以通过简单cope重排直接获得β-榄香烯。

3、gas广泛分布于植物及微生物中，目前已有不少研究通过在重组工程菌表达gas用于合成(+)-吉马稀a，对应的cope重排产物为(-)-β-榄香烯。然而，研究者们已发现(+)-β-榄香烯的存在(β-榄香烯的分析检测方法及制备技术研究进展，黄汉昌)，如化合物i所示：其对应的前体化合物为(-)-吉马稀a,如化合物ii所示：然而合成(-)-吉马稀a的合酶却鲜有被报道。

技术实现思路

1、本发明提供了一种(-)-吉玛烯a的合成酶，用于通过生物途径生产(+)-β-榄香烯。

2、本发明提供了一种用于生成(-)-吉玛烯a的蛋白质，所述蛋白质包含如下区段：1)氨基酸序列为x1y1x2y2w的多肽；2)氨基酸序列为x3y3y4y5y6l的多肽；3)氨基酸序列为ly7y8y9x4y10r的多肽；4)氨基酸序列为y11y12y13x5y14的多肽。

3、进一步的，所述x1的氨基酸可以为y、h、e、q，优选q或者e或者h，优选q或者e，优选e；y1的氨基酸可以为s、a、l、t,优选s、a，更优选s；x2的氨基酸可以为l、a、t，优选a、t，更优选a；y2的氨基酸可以为c、a、d，优选a；x3的氨基酸可以为r、g、a、p，优选a、g，更有选a；y3的氨基酸可以为l、f、m，优选l、f，更优选l；y4的氨基酸可以为l、i，优选l，y5的氨基酸可以为e、d、a，优选d、e，更优选d；y6的氨基酸可以为i、v，优选v；y7的氨基酸可以为a、h、d、r、k，优选a、d，更优选a；y8的氨基酸可以为d、e、n，优选d；y9的氨基酸可以为l、i、m，优选l、i，更优选l；x4的氨基酸可以为r、c、w、i，优选c、w、i，优选c、i，优选c；y10的氨基酸可以为r、k、q、l、n，优选r；y11的氨基酸可以为r、w、y、l，优选r；y12的氨基酸可以为n、a、v、k、q、s，优选a、s、v，优选a、s，更优选a；y13的氨基酸可以为h、d、n、a，优选d；x5的氨基酸可以为p、a、d、e、s，优选p、e、d、s，优选p、s，更优选p；y14的氨基酸可以为a、r、e、d、q、l，优选q、a，优选q。

4、进一步的，本发明提供了一种用于合成(-)-吉玛烯a的蛋白质，所述蛋白质具有包含如下区段：1)氨基酸序列为x1sx2aw的多肽；2)氨基酸序列为x3lldvl的多肽；3)氨基酸序列为ladx4rr的多肽；4)氨基酸序列为radx5q的多肽；其中x1的氨基酸可以为e、q、h，优选e、q，优选e；x2的氨基酸可以为a、d，优选a；x3的氨基酸可以为a、g，优选a；x4的氨基酸可以为c、i，优选c；x5的氨基酸可以为p、s，优选p。

5、进一步的，所述区段1)的氨基酸位点对应于seq id no.4所示的第28-31位；所述区段2)的氨基酸位点对应于seq id no.4所示的第101-106位；所述区段3)的氨基酸位点对应于seq id no.4所示的第125-131位；所述区段4)的氨基酸位点对应于seq id no.4所示的第203-208位。

6、进一步的，本发明提供了一种用于合成(-)-吉玛烯a的氨基酸序列如seq id no.4所示蛋白质，所述蛋白质的第28-31位被替换为x1sx2aw，第101-106位被替换为x3lldvl，第125-131位被替换为ladx4rr，第203-208位被替换为radx5q，其中x1的氨基酸可以为e、q、h，优选e、q，优选e；x2的氨基酸可以为a、d，优选a；x3的氨基酸可以为a、g，优选a；x4的氨基酸可以为c、i，优选c；x5的氨基酸可以为p、s，优选p。

7、进一步的，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no.4所示、seq id no.6所示、seqid no.8所示、seq id no.10所示、seq id no.12所示、seq id no.14所示、seq id no.16所示或者与其具有90％以上或者99％以上同源性，优选如seq id no.4、seq id no.6、seq idno.10、seq id no.12、seq id no.14、seq id no.16所示。

8、进一步的，所述蛋白质来源于小单孢菌，优选来源于海洋小单孢菌，优选来源于海洋小单孢菌ab-18-032，所述来源是指基因的原始来源宿主不同。

9、本发明进一步提供了一种核酸序列，所述核酸序列编码如上述氨基酸。

10、进一步的，所述核酸序列如seq id no.5、seq id no.7、seq id no.3、seq idno.9、seq id no.11、seq id no.13、seq id no.15所示。

11、进一步的，本发明提供了一种与前述任一项所述的核苷酸、蛋白质相关的生物材料，所述相关生物材料为如下任何一项所示：

12、a1)一种含有上述的核酸分子的表达盒；优选所述表达盒包括启动子、上述核酸分子和终止子；优选所述启动子选自于tef1、pgk1，所述终子止选自于cyc1、adh1。

13、a2)一种宿主细胞，含有上述所述的核酸分子或上述任一项所述的蛋白质或含有所述的核酸分子的表达盒或包含所述的重组载体；或，

14、a4)一种重组载体，其特征在于所述重组载体包含上述核酸分子或者表达上述编码核酸分子，优选所述重组载体包括启动子、上述核酸分子和终止子；优选所述启动子选自于tef1、pgk1，所述终子止选自于cyc1、adh1；优选所述重组载体序列如seq id no.18-seqid no.24所示。

15、a5)一种转基因植物，包含上述核酸分子或上述蛋白质或所述表达盒或所述的重组载体或所述的宿主细胞。

16、进一步的，本发明提供了上述任意一条所述的核苷酸序列、蛋白质序列或相关生物材料在法尼基焦磷酸fpp为底物下，催化生成(-)-吉马烯a的应用。

17、进一步的，本发明提供了一种生产(-)-吉玛烯a的方法，其特征在于所述方法包括：

18、1)提供法尼焦磷酸(fpp)前体，

19、2)使fpp前体与酶接触，所述酶用于催化fpp前体生成(-)-吉玛烯a，优选所述酶选自于上述所述蛋白质。

20、进一步的，所述酶为异源提供前体的微生物中的酶。

21、进一步的，所述微生物是酵母或大肠杆菌。

22、本发明进一步提供了一种能够生成(-)-吉玛烯a的经遗传修饰的宿主细胞，包含1)编码甲羟戊酸途径中一种或多种用于生成法尼焦磷酸的酶的一种或多种异源核酸；和2)编码用于生成(-)-吉玛烯a的酶的异源核酸，所述酶选自于上述蛋白质。

技术特征：

1.一种用于生成(-)-吉玛烯a的蛋白质，其特征在于所述蛋白质包含如下区段：1)氨基酸序列为x1y1x2y2w的多肽；2)氨基酸序列为x3y3y4y5y6l的多肽；3)氨基酸序列为ly7y8y9x4y10r的多肽；4)氨基酸序列为y11y12y13x5y14的多肽。

2.根据权利要求1所示的蛋白质，其特征在于所述x1的氨基酸选自于y、h、e、q，优选q或者e或者h，优选q或者e，优选e；y1的氨基酸选自于s、a、l、t,优选s、a，更优选s；x2的氨基酸选自于l、a、t，优选a、t，更优选a；y2的氨基酸选自于c、a、d，优选a；x3的氨基酸选自于r、g、a、p，优选a、g，更有选a；y3的氨基酸选自于l、f、m，优选l、f，更优选l；y4的氨基酸选自于l、i，优选l，y5的氨基酸选自于e、d、a，优选d、e，更优选d；y6的氨基酸选自于i、v，优选v；y7的氨基酸选自于a、h、d、r、k，优选a、d，更优选a；y8的氨基酸选自于d、e、n，优选d；y9的氨基酸选自于l、i、m，优选l、i，更优选l；x4的氨基酸选自于r、c、w、i，优选c、w、i，优选c、i，优选c；y10的氨基酸选自于r、k、q、l、n，优选r；y11的氨基酸选自于r、w、y、l，优选r；y12的氨基酸选自于n、a、v、k、q、s，优选a、s、v，优选a、s，更优选a；y13的氨基酸选自于h、d、n、a，优选d；x5的氨基酸选自于p、a、d、e、s，优选p、e、d、s，优选p、s，更优选p；y14的氨基酸选自于a、r、e、d、q、l，优选q。

3.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述蛋白质具有如seq id no.4所示的氨基酸序列，其特征在于所述氨基酸序列的第28-31位被替换为x1sx2aw，第101-106位被替换为x3lldvl，第125-131位被替换为ladx4rr，第203-208位被替换为radx5q，其中x1的氨基酸可以为e、q、h，优选e、q，优选e；x2的氨基酸可以为a、d，优选a；x3的氨基酸可以为a、g，优选a；x4的氨基酸可以为c、i，优选c；x5的氨基酸可以为p、s，优选p。

4.根据权利要求1所示的蛋白质，其特征在于所述区段1)的氨基酸位点对应于seq idno.4所示的第28-31位；所述区段2)的氨基酸位点对应于seq id no.4所示的第101-106位；所述区段3)的氨基酸位点对应于seq id no.4所示的第125-131位；所述区段4)的氨基酸位点对应于seq id no.4所示的第203-208位。

5.根据权利要求4所述的蛋白质，其特征在于所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no.4所示、seq id no.6所示、seq id no.8所示、seq id no.10所示、seq id no.12所示、seq idno.14所示、seq id no.16所示或者与其具有90％以上或者99％以上同源性。

6.根据权利要求1-5任一项所述蛋白质，其特征在于所述蛋白质来源于小单孢菌，优选来源于海洋小单孢菌，优选来源于海洋小单孢菌ab-18-032。

7.一种核酸序列，其特征在于所述核酸序列编码权利要求1-6所述的氨基酸。

8.根据权利要求7所示的核酸序列，其特征在于所述核酸序列如seq id no.5、seq idno.7、seq id no.3、seq id no.9、seq id no.11、seq id no.13、seq id no.15所示或者与其具有90％以上或者99％以上同源性。

9.一种与权利要求1-8任一项所述的核苷酸、蛋白质相关的生物材料，所述相关生物材料为如下任何一项所示：

10.权利要求1-9任一项所述的核苷酸序列、蛋白质序列或相关生物材料在法尼基焦磷酸fpp为底物下，催化生成(-)-吉马烯a的应用。

11.一种生产(-)-吉玛烯a的方法，其特征在于所述方法包括：

12.一种能够生成(-)-吉玛烯a的经遗传修饰的宿主细胞，其特征在于包含1)编码甲羟戊酸途径中一种或多种用于生成法尼焦磷酸的酶的一种或多种异源核酸；和2)编码用于生成(-)-吉玛烯a的酶的异源核酸，优选所述酶选自于权利要求1-6任一项所述的蛋白质。

技术总结
本发明涉及一种用于生成(‑)‑吉玛烯A的蛋白质，所述蛋白质包含如下区段：1)氨基酸序列为X1Y1X2Y2W的多肽；2)氨基酸序列为X3Y3Y4Y5Y6L的多肽；3)氨基酸序列为LY7Y8Y9X4Y10R的多肽；4)氨基酸序列为Y11Y12Y13X5Y14的多肽，有效实现了(+)‑β‑榄香烯的合成。

技术研发人员：柯潇,毛王伟,罗昊,张俊,邱景德
受保护的技术使用者：四川弘合生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5