一种桑细菌性枯萎病的检测诊断方法及检测诊断产品

本发明属于病原微生物检测。更具体地，涉及一种检测诊断桑细菌性枯萎病的方法及检测产品。

背景技术：

1、桑树是药食同源的树木之一，原产自中国多年生木本植物，如今在许多国家和地区都有种植。桑叶不仅作为养蚕必要的饲养食材，种好桑才能养好蚕，提升蚕茧蛹的质量与产量，制作成丝绸出销国内外，至2022年，我国丝绸工业年产值超过1500亿元，而且，由于桑叶富含多酚类、多糖类、黄酮类等活性物质，具有降血糖、降血脂、抑菌等药用功效，已作为物美价廉的可食用桑叶产品进入人们的日常饮食中，因此桑树病害的流行备受关注。尤其是桑树细菌性病害在各桑树种植区十分常见，其中桑疫病、桑细菌性枯萎病和桑青枯病是危害我国桑树产业最主要的三大桑树细菌性病害，制约着桑树产业的发展。

2、桑细菌性枯萎病发病时呈现树木衰败，树枝维管组织变褐，叶片先一侧萎蔫、全叶萎缩变褐至叶片脱落，最终整棵树枯死，桑园由零星分布的桑树枯萎死亡迅速蔓延至大面积桑树枯死毁灭性现象。桑细菌性枯萎病田间症状与由茄科雷尔式菌ralstoniasolanacearum引发的桑青枯病极为相似，但桑细菌性枯萎病的发病症状一般是从桑树的根部开始向上发展。目前报道的桑细菌性枯萎病病原菌的种类分别是阴沟肠杆菌enterobacter cloacae和阿氏肠杆菌enterobacter asburiae、肺炎克雷伯氏菌klebsiella pneumoniae、klebsiella variicola和产酸克雷伯氏菌klebsiella oxytoca以及菠萝泛菌pantoea ananatis。由此可见桑树枯萎病发病机制复杂，病原菌种类多样。且由于桑细菌性枯萎病田间症状与其他病原菌引发的桑青枯病极为相似，更加难以鉴定桑细菌性枯萎病并针对其进行有效防控。

3、而桑细菌性枯萎病的病原菌存在于植物甚至是可食用部位，桑叶属于药食同源植物，且其中的病原菌克雷伯氏菌也属于动物源致病菌，对消费者的健康构成潜在风险，导致相关疾病的爆发。因此，桑细菌性枯萎病的病原菌鉴定与检测技术具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有桑细菌性枯萎病病原菌相关研究的不足，鉴定了一种新的桑细菌性枯萎病病原菌，并提供了一种特异性检测诊断方法及检测诊断产品。

2、本发明的目的是提供一种特异性检测桑细菌性枯萎病病原菌的引物。

3、本发明又一目的是提供所述特异性检测桑细菌性枯萎病病原菌的引物应用。

4、本发明另一目的是提供一种桑细菌性枯萎病的检测诊断方法。

5、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

6、本发明在桑枯萎病样中首次分离并鉴定出桑细菌性枯萎病病原菌产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)，并通过klebsiella aerogenes回感无菌苗验证显示klebsiellaaerogenes能浸染桑无菌苗感染桑细菌性枯萎病，其病症与桑细菌性枯萎病一致，再从感病部分离病原菌验证得到klebsiella aerogenes也属于桑细菌性枯萎病的病原菌，并通过检测该病原菌的csgd毒力基因，显示存在致病性。

7、因此，本发明要求保护产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)在作为桑细菌性枯萎病诊断标志物中的应用。

8、以及检测产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)的试剂在检测诊断桑细菌性枯萎病或制备桑细菌性枯萎病检测诊断产品中的应用。

9、作为可选择的优选方案，检测试剂可以是基因检测试剂，如可检测产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)的pcr检测试剂。

10、本发明针对病原菌产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)进行检测研究，筛选得能特异性检测桑细菌性枯萎病病原菌的引物对bglb5，引物bglb5包括上游引物5'-cagcacggtatccccgat-3'和下游引物5'-catctatttgcgcgctgc tat-3'；该引物能很好地区分不同桑细菌性枯萎病病原种类以及与其病症相近似、或同源性较高的其他病原菌，且该引物对的最低检测限达100.0pg/μl，能够用于诊断和鉴定桑细菌性枯萎病及其病原菌种类。

11、因此，本发明提供一种特异性检测桑细菌性枯萎病的引物，所述引物为能够检测产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)病原菌的引物。

12、优选地，所述引物包括上游引物5'-cagcacggtatccccgat-3'和下游引物5'-catctatttgcgcgctgctat-3'。

13、本发明保护特异性检测桑细菌性枯萎病病原菌的引物在鉴定桑细菌性枯萎病病原菌产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)或在制备鉴定桑细菌性枯萎病病原菌产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)的产品、或在诊断桑细菌性枯萎病或在制备桑细菌性枯萎病的检测诊断产品中的应用。

14、另外，本发明还提供一种桑细菌性枯萎病的检测诊断方法，以产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)为检测对象，若待测样本检出产气克雷伯菌(klebsiellaaerogenes)，则待测样本患有桑细菌性枯萎病。特别地，该检测方法不限于分子手段，如pcr扩增、定量检测等。

15、作为优选地实施方案，本发明提供一种桑细菌性枯萎病的检测诊断方法，包括以下步骤：

16、s1.提取待测样本基因组dna；

17、s2.以待测样本dna为模板，采用能够检测产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)的引物进行pcr扩增；

18、s3.根据扩增结果判断该样本中是否含有产气克雷伯菌(klebsiellaaerogenes)；

19、若样本中含有产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)，则样本患有桑细菌性枯萎病。

20、优选地，在步骤s1中提取待测植株新鲜幼嫩的叶片。

21、优选地，步骤s2中扩增反应体系为：taq pcr master mix 12.5μl，上游引物f和下游引物r各1μl、dna模板2μl，加ddh2o至25μl。

22、优选地，步骤s2中扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环；72℃延伸10min，于4℃保存。

23、优选地，所述能够检测产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)的引物为上游引物5'-cagcacggtatccccgat-3'和下游引物5'-catctatttgcgcgctgc tat-3'。

24、优选地，步骤s3的判断方法为：进行琼脂糖凝胶电泳检测，当扩增产物带型大小在73pb时，且显示为清晰的亮带，即为样本中含有产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)。

25、本发明还提供一种桑细菌性枯萎病的检测诊断产品，含有能够检测产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)的引物。

26、优选地，所述产品为检测试剂盒，含上述特异性检测桑细菌性枯萎病病原菌的引物。

27、更优选地，所述试剂盒还包含提取待测样本基因组dna的试剂，进行pcr扩增的试剂。

28、另外，本发明还提供一种桑树资源的质量检测方法，以产气克雷伯菌(klebsiellaaerogenes)为检测对象，若待测桑树资源检出产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)，则表示该桑树资源被克雷伯氏菌污染或感染。

29、本发明具有以下有益效果：

30、本发明首次分离并鉴定出桑细菌性枯萎病病原菌产气克雷伯菌(klebsiellaaerogenes)，其回感无菌苗验证显示该病原菌能浸染桑无菌苗感染桑细菌性枯萎病，其病症与桑细菌性枯萎病一致；并通过检测该病原菌的csgd毒力基因，显示该病原菌存在致病性。

31、本发明进一步研究得到能特异性检测桑细菌性枯萎病病原菌klebsiellaaerogenes的引物对，该引物能很好地区分不同的桑细菌性枯萎病病原种类以及与其病症相近似、或同源性较高的其他病原菌，且该引物对的最低检测限达100.0pg/μl，能够用于诊断和鉴定桑细菌性枯萎病及其病原菌种类。

32、同时，本发明还提供一种桑细菌性枯萎病的检测诊断方法以及桑树资源的质量检测方法，以产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)为检测对象，为检测食源性病原菌以及桑树新发病原菌的绿色防治提供理论依据。

技术特征：

1.产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)在作为桑细菌性枯萎病诊断标志物中的应用。

2.检测产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)的试剂在检测诊断桑细菌性枯萎病或制备桑细菌性枯萎病检测诊断产品中的应用。

3.一种特异性检测桑细菌性枯萎病的引物，其特征在于，所述引物为能够检测产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)病原菌的引物，包括上游引物5'-cagc acggtatccccgat-3'和下游引物5'-catctatttgcgcgctgctat-3'。

4.权利要求3所述引物在鉴定桑细菌性枯萎病病原菌产气克雷伯菌(klebsiellaaerogenes)或在制备鉴定桑细菌性枯萎病病原菌产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)的产品中的应用。

5.权利要求3所述引物在诊断桑细菌性枯萎病或在制备桑细菌性枯萎病的检测诊断产品中的应用。

6.一种桑细菌性枯萎病的检测诊断方法，其特征在于，以产气克雷伯菌(klebsiellaaerogenes)为检测对象，若待测样本检出产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)，则待测样本患有桑细菌性枯萎病。

7.一种桑细菌性枯萎病的检测诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述能够检测产气克雷伯菌(klebsiellaaerogenes)的引物为上游引物5'-cagcacggtatccccgat-3'和下游引物5'-catctatttgcgcgctgctat-3'。

9.一种桑细菌性枯萎病的检测诊断产品，其特征在于，含有能够检测产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)的引物。

10.一种桑树资源的质量检测方法，其特征在于，以产气克雷伯菌(klebsiellaaerogenes)为检测对象，若待测桑树资源检出产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)，则表示该桑树资源被克雷伯氏菌污染或感染。

技术总结
本发明公开了一种桑细菌性枯萎病的检测诊断方法及检测诊断产品。本发明首次分离并鉴定出桑细菌性枯萎病病原菌产气克雷伯菌，经验证显示该病原菌能浸染桑无菌苗感染桑细菌性枯萎病，通过检测该病原菌的CsgD毒力基因，显示存在致病性，因此该病菌可以作为桑细菌性枯萎病的诊断病原菌。进一步研究出一组能特异性检测病原菌的引物，能很好地区分其他不同的桑细菌性枯萎病病原种类以及与其病症相近似、或同源性较高的其他病原菌，且该引物的最低检测限达100.0pg/μL。基于此，本发明还提供一种桑细菌性枯萎病的检测诊断方法，可以通过早期筛选出桑细菌性枯萎病植株，为检测食源性病原菌以及桑树新发病原菌的绿色防治提供技术支持。

技术研发人员：刘吉平,张雪吟
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5