基于UPLC-MS的抑制晚期糖基化终产物活性的药物的筛选方法

本发明属于药物筛选，涉及一种基于uplc-ms的抑制晚期糖基化终产物活性的药物的筛选方法。

背景技术：

1、晚期糖基化终产物(ages)是通过蛋白质的非酶促糖基化产生的复杂分子实体，涉及还原糖的羰基与蛋白质的游离氨基之间的反应。该反应导致可逆席夫碱的形成，随后，最初的席夫碱发生重排，形成amadori产物，进一步氧化生成二羰基化合物，形成交联荧光(例如戊糖苷)和非荧光加合物(例如nε-羧甲基赖氨酸)，称为晚期糖基化终产物。这些化合物通常具有复杂的结构，并且可以在蛋白质的表面提供多种生物学功能。ages可以用来调节蛋白质的活性、稳定性和亲和力，从而对蛋白质在体内的功能和生物学活性产生重要的影响。

2、糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病。糖尿病患者发生各种并发症的风险增加，其中包括心血管疾病、视网膜病变、肾脏损害、神经损害等。ages在糖尿病并发症中扮演着重要的角色。研究表明，糖尿病患者持续的高血糖会诱导体内多种蛋白质的非酶促糖基化，导致ages水平升高，并进一步引发一系列糖尿病并发症。目前常用的ages抑制剂是氨基胍，然而，尽管氨基胍具有强大的糖基化抑制作用，但它也有着严重的副作用。某些天然产物，特别是富含具有抗氧化特性的黄酮类化合物已被证明对ages具有抑制作用。因此，无毒无副作用基于天然植物的抑制剂正在成为一种有前途的替代品。然而，鉴于现有药物种类繁多，如何快速筛选出相关药物尤为重要。

3、高效液相色谱-质谱(hplc-ms/ms)通过将样品中的糖基化蛋白质先在高效液相色谱器中进行分离，再将分离后的组分送入质谱仪进行分析。质谱(ms)技术是一种分析化学物质组成和结构的技术。它通过离子化样品并在电场或磁场中分离离子，来测量离子的质量和相对离子强度。通过与高效液相色谱(hplc)联用，可以将高灵敏度和高分辨率的质谱技术与高效率和高选择性的液相色谱技术结合起来，提高分析的准确性和灵敏度。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于uplc-ms的抑制晚期糖基化终产物活性的药物的筛选方法，以实现快速筛选抑制ages的药物。

2、实现本发明目的的技术方案如下：

3、基于uplc-ms的抑制晚期糖基化终产物活性的药物的筛选方法，包括以下步骤：

4、(1)药物的提取：

5、将筛选中药破碎成粉末，然后在95％乙醇溶液中蒸煮2h以提取中药成分，最后在60℃下蒸发浓缩，直至呈膏状，得到中药提取物；

6、(2)体外ages的合成：

7、设置模型组、空白组和给药组，各组的处理方式如下：

8、模型组：将浓度为5mg/ml的牛血清白蛋白(bsa)与0.5mol/l的d-核糖在ph7.4的pbs中混合，室温下放置一天进行充分溶解，用0.22μm无菌滤头过滤除菌，将混合物在5％co2-95％o2中于37℃温育14天；

9、空白组：使用浓度为5mg/ml的牛血清白蛋白，用0.22μm无菌滤头过滤除菌，在5％co2 -95％o2中于37℃温育14天；

10、给药组：将浓度为5mg/ml的牛血清白蛋白与0.5mol/l的d-核糖在ph7.4的pbs中混合，室温下放置一天进行充分溶解，用0.22μm无菌滤头过滤除菌，将中药提取物用10％二甲基亚砜(dmso)溶解，过滤除菌之后，按2mg/ml的添加量加入到bsa和d-核糖的混合反应体系中，将混合物在5％co2-95％o2中于37℃温育14天；

11、(3)液质检测ages：

12、孵育后，对各组样品用pbs透析以除去未反应的糖，然后将样品冻干后溶于水中，并加入硼氢化钠的硼酸钠缓冲液，室温温育2小时，然后添加三氟乙酸溶液(tfa)，12000g离心10分钟沉淀蛋白质，再次加入等量的三氟乙酸溶液并离心，除去上清液，除去所有tfa后，添加hcl，然后在氮吹作用下将混合物加热至110℃，加热20小时，在氮吹作用下将液体吹干，并将固体物质溶解在lc-ms/ms起始洗脱液中，进行液质测试，流动相中，溶剂a：0.1％甲酸水(v/v,)，溶剂b：乙腈，流速0.3ml/min，柱温40℃，梯度洗脱程序如下；

13、

14、质谱条件：离子源esi(electrospray ionization)源，检测方式为正离子检测，参数如下：

15、

16、分析各组中合成的ages的含量；

17、(4)细胞高糖模型的建立：

18、将hbzy-1(大鼠肾小球系膜细胞)细胞在不含胎牛血清的培养基中饥饿处理12h，设置模型组、空白组和给药组，各组的处理方式如下：

19、空白组：饥饿处理后的hbzy-1细胞用dmem低糖培养基培养48h；

20、模型组：饥饿处理后的hbzy-1细胞用dmem高糖培养基培养48h；

21、给药组：中药提取物用dmso溶解，用无菌滤头过滤除菌，加入到dmem高糖培养基中，使药物浓度为100g/ml，然后接种饥饿处理后的hbzy-1细胞，细胞培养48h；

22、(5)液质检测细胞中的ages

23、在各组中加入甲醇，然后用刮刀将细胞从板上机械分离并转移到玻璃小瓶中，完全干燥，向每个样品中加入hcl，再将样品在110℃的氮吹加热块中孵育20小时，然后在氮吹作用下干燥，将底部固体溶解在含0.1％甲酸的乙腈和水的混合溶液中，水:乙腈的体积比为1:1，进行液质测试，液质条件同步骤(3)，分析各组中合成的ages的含量；

24、(6)根据步骤(3)和(5)中合成的ages的含量，综合分析，筛选出合成的ages的含量相对最低的药物。

25、优选地，步骤(3)中，硼氢化钠的硼酸钠缓冲液中，硼氢化钠的浓度为100mm，硼酸钠缓冲液的浓度为200mm，ph为9.2。

26、优选地，步骤(3)中，三氟乙酸溶液的浓度为200g/l。

27、优选地，步骤(3)中，以ida(information-dependent basis)模式采集数据，在每个数据采集周期中，选择信号强度最高、质荷比(m/z)大于100的分子离子进行二级质谱采集，离子的裂解使用轰击能量为35±15ev，每个产物离子的累积时间为50ms。

28、优选地，步骤(4)中，低糖培养基的葡萄糖浓度为5.6mm，含有5％热灭火的胎牛血清和1％青霉素-链霉素；高糖培养基的葡萄糖浓度为30mm，含有5％热灭火的胎牛血清和1％青霉素-链霉素。

29、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

30、(1)本发明方法首先将样品进行水解和纯化，然后在hplc中使用不同的溶剂系统将样品中的糖基化蛋白质分离出来。分离后的组分再通过质谱仪进行分析，确定糖基化位点，并确定糖基化的类型和数量。与传统的elisa法相比，该方法大大提高了分析的准确性和灵敏度，并且可以确定糖基化位点和类型。

31、(2)本发明先在体外合成ages来确定所选药物是否具有抑制ages的能力，利用高糖模型细胞实验筛选出具有最高抑制能力的药物，利用糖尿病模型动物实验确定所筛药物在体内的有效性及剂量差异，以此来快速筛选所需药物，该方法简单高效。

技术特征：

1.基于uplc-ms的抑制晚期糖基化终产物活性的药物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，硼氢化钠的硼酸钠缓冲液中，硼氢化钠的浓度为100mm，硼酸钠缓冲液的浓度为200mm，ph为9.2。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，三氟乙酸溶液的浓度为200g/l。

4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，以ida模式采集数据，在每个数据采集周期中，选择信号强度最高、质荷比大于100的分子离子进行二级质谱采集，离子的裂解使用轰击能量为35±15ev，每个产物离子的累积时间为50ms。

5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(4)中，低糖培养基的葡萄糖浓度为5.6mm，含有5％热灭火的胎牛血清和1％青霉素-链霉素；高糖培养基的葡萄糖浓度为30mm，含有5％热灭火的胎牛血清和1％青霉素-链霉素。

技术总结
本发明公开了一种基于UPLC‑MS的抑制晚期糖基化终产物活性的药物的筛选方法。所述方法使用牛血清蛋白与核糖在体外合成AGEs来确定所选药物是否具有抑制AGEs的能力，选择具有抑制能力的药物；然后使用高糖细胞模型模拟体内糖尿病，细胞实验鉴定出具有最高抑制能力的药物；最后建立糖尿病动物模型，以检测细胞实验中筛选的本发明方法简单高效，可以快速筛选治疗AGEs相关疾病的所需药物。

技术研发人员：汪俊松,高明哲
受保护的技术使用者：南京理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5