植物来源细胞色素P450的鉴定及其应用
本发明涉及新鉴定的植物来源的细胞色素p450多肽及其在甾体化合物生产中的应用。
背景技术：
1、c21甾体物质(例如，孕烯醇酮、黄体酮、氢化可的松等)是一类重要的化合物，被证明在动物中存在显著的生理作用，例如调节内分泌、抗炎、抗肿瘤作用。目前c21甾体物质的生产主要有两类工业路线：双烯法和4-ad法。然而，双烯法和4-ad法基础性原料是主要是经过植物提取分离得到的薯蓣皂素、豆甾醇等化合物。一方面，生产这些化合物浪费了大量的土地资源，提取分离剩余的残渣对环境的危害很大。另一方面，部分甾体化合物需要通过化学合成的方式进行结构衍生获得，这个过程需要大量的有毒有害的试剂，可持续性差。因此，构建微生物细胞工厂以葡萄糖为底物从头合成c21甾体化合物，具有经济节约、环境友好的优势，其作为合成生物学方法发展的第3条路线的潜力值得期待。高效的生物合成途径解析是合成生物学生产前提。科学家在动物中鉴定了孕烯醇酮、黄体酮等c21化合物的生物合成途径，但由于酶的活性低，制约整个以葡萄糖等廉价碳源从头合成路线的发展。
2、早期有科学家在植物中检测到c21甾体类化合物，而且丰度高达12％干细胞重，但其生物合成途径及途径的催化活性未知。
3、因此，有需要鉴定高活性的参与c21化合物的生物合成途径的酶，例如植物来源的酶。
技术实现思路
1、为满足上述需要，发明人在植物通关藤(marsdenia tenacissima)中挖掘了能够催化菜油甾醇、胆固醇合成孕烯醇酮的关键酶mtcyp108和mtcyp150(其鉴定为细胞色素p450)，并以其编码基因构建了能够生成孕烯醇酮工程菌，为从头生物合成c21甾体类药物提供了重要基础。
2、在第一方面，本发明提供一种分离的多肽，其包含seq id no:13或14的氨基酸序列。
3、在第二方面，本发明提供编码本发明的多肽的分离的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体。
4、在第三方面，本发明提供一种重组的宿主细胞，优选酵母细胞，例如酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)细胞，其包含本发明的多核苷酸或载体。
5、在一些实施方案中，所述多核苷酸整合入所述宿主细胞的基因组。
6、在一些实施方案中，所述宿主细胞还包含编码胆固醇和/或菜油甾醇生物合成相关的蛋白质的多核苷酸。
7、在一些实施方案中，所述胆固醇生物合成相关的蛋白质选自3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶、蛋白质二硫化物异构酶、ino2蛋白质；细胞色素p450还原酶、7-脱氢胆固醇还原酶和甾醇24位还原酶；和/或其中所述菜油甾醇生物合成相关的蛋白质选自3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶，细胞色素p450还原酶、7-脱氢胆固醇还原酶。
8、在一些实施方案中，所述宿主细胞缺失半乳糖激酶基因，例如gal1、gal7和gal10基因中的一个或多个。
9、在第四方面，本发明提供一种多肽-膜复合物，其包含本发明的多肽和包含脂质双分子层的膜。
10、在第五方面，本发明提供一种制备孕烯醇酮的方法，包括将本发明的宿主细胞或复合物与胆固醇和/或菜油甾醇接触。
11、在一些实施方案中，本发明的制备孕烯醇酮的方法包括在适合其生长的条件下培养本发明的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码胆固醇和/或菜油甾醇生物合成相关的蛋白质的多核苷酸。
技术特征：
1.一种分离的多肽，其包含seq id no:13或14的氨基酸序列。
2.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1的多肽。
3.一种载体，其包含权利要求2的多核苷酸。
4.一种重组的宿主细胞，例如真核细胞，优选酵母细胞，例如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)细胞，其包含权利要求2的多核苷酸或权利要求3的载体。
5.权利要求4的宿主细胞，其中所述多核苷酸整合入所述宿主细胞的基因组。
6.权利要求4或5的宿主细胞，其还包含编码胆固醇和/或菜油甾醇生物合成相关的蛋白质的多核苷酸。
7.权利要求4-6任一项的宿主细胞，其中所述胆固醇生物合成相关的蛋白质选自3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶、蛋白质二硫化物异构酶、ino2蛋白质；细胞色素p450还原酶、7-脱氢胆固醇还原酶和甾醇24位还原酶；和/或其中所述菜油甾醇生物合成相关的蛋白质选自3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶，细胞色素p450还原酶、7-脱氢胆固醇还原酶。
8.权利要求4-7任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞缺失半乳糖激酶基因。
9.权利要求8的宿主细胞，其中所述半乳糖激酶基因是gal1、gal7和gal10基因中的一个或多个。
10.一种多肽-膜复合物，其包含权利要求1的多肽和包含脂质双分子层的膜。
11.一种制备孕烯醇酮的方法，包括将权利要求4或5的宿主细胞或权利要求10的复合物与胆固醇和/或菜油甾醇接触。
12.一种制备孕烯醇酮的方法，包括在适合其生长的条件下培养权利要求6-9任一项的宿主细胞。
技术总结
本发明涉及细胞色素P450多肽、编码所述多肽的核酸或载体、包含或表达所述多肽的宿主细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。本发明还涉及使用所述多肽或宿主细胞制备孕烯醇酮的方法。
技术研发人员：张学礼,戴住波,李荣生,郭爽
受保护的技术使用者：中国科学院天津工业生物技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5