一种磁珠-甘露糖结合凝集素复合物、构建方法及其应用

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种磁珠-甘露糖结合凝集素复合物、构建方法及其应用。

背景技术：

1、高通量测序技术能够提供病原体的基因组信息，有助于从致病性、耐药性以及变异进化等多个维度了解病原体的生物学特征。由高通量测序技术发展而来的临床宏基因组学在近10年中被应用于临床微生物诊断领域。高通量测序与其它组学技术相结合，可以同时分析细菌组、病毒组、转录组、蛋白质组以及代谢组的动态变化，揭示共生微生物及其代谢产物如何影响局部微生态组成、免疫应答和生化反应过程。

2、在分析人体微生物组尤其是呼吸道等微生物含量较低的样本时，由于人体基因组长度(3×109碱基)大约是一般细菌基因组平均长度(3×106碱基)的1000倍，在进行宏基因组测序时大量的数据来自人体细胞的基因，成为微生物组数据获取和分析的背景噪音，干扰对微生物种群组成和功能的阐释。尽管通过提高测序深度能够一定程度上增加微生物组数据量，但该策略会增加测序成本和数据分析时间，并对计算机的分析性能提出较高要求。

3、目前宏基因组测序应用于临床的主要技术难度是如何降低测序结果中的宿主背景影响，提高微生物的测序数据丰度。在测序前对样本中的微生物进行富集以减少宿主细胞和核酸，可增加微生物组数据信息，有助于更好地揭示微生物的组成和功能。目前宏基因组测序研究多采用在微生物核酸提取前预先裂解宿主细胞并使用核酸酶或叠氮溴化丙锭(propidiummonoazide,pma)降解宿主核酸的策略，以降低测序数据中的宿主背景噪声。虽然基于渗透压和皂苷等原理，可以利用人体细胞与微生物间生物学性质的差异实现宿主核酸的清除，但部分研究表明原生生物、无细胞壁细菌、革兰氏阳性菌和有包膜病毒对于该处理方法的稳定性相对较低，在离心、洗涤以及核酸酶消化过程中可伴随肺炎链球菌和甲型流感病毒核酸片段的损失[参见：hasan,m.r.,a.rawat,p.tang,et al.,depletion ofhuman dna in spiked clinical specimens for improvement of sensitivity ofpathogen detection by next-generation sequencing.j clin microbiol,2016.54(4):p.919-27.]。

4、因此，如何在对呼吸道微生物测序之前，对呼吸道样本中的微生物进行富集以减少宿主细胞和核酸是一个关键问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提出一种磁珠-甘露糖结合凝集素复合物、构建方法及其应用，该磁珠-甘露糖结合凝集素复合物对呼吸道样本中的微生物具有较高的富集效率，从而能够降低测序结果中的宿主背景影响，提高呼吸道微生物的测序数据丰度。

2、基于上述目的，本发明的第一个方面提供了一种磁珠-甘露糖结合凝集素复合物，其中，磁珠与甘露糖结合凝集素通过-(ch2)3chohch2nh-基团连接。

3、在本发明的优选的实施方案中，所述磁珠为环氧树脂磁珠；

4、优选地，所述磁珠为dynabeadstmm-270epoxy环氧树脂磁珠。

5、本发明的第二个方面提供了一种构建磁珠-甘露糖结合凝集素复合物的方法，其中，将磁珠与甘露糖结合凝集素混合后，孵育。

6、在本发明的优选的实施方案中，在磁珠的悬浮液中加入硫酸铵溶液和甘露糖结合凝集素蛋白液，混合后，孵育；

7、优选地，所述硫酸铵溶液的浓度为1-3mol/l；硫酸铵溶液作为磁珠表面携带的环氧基团与甘露糖结合凝集素的伯氨基发生偶联反应的缓冲液，为磁珠与甘露糖结合凝集素的偶联过程提供合适的ph值和盐离子强度；更优选地，所述硫酸铵溶液的浓度为3mol/l；

8、优选地，将磁珠与甘露糖结合凝集素按照(2～5)×108磁珠/100μg甘露糖结合凝集素的比例混合；

9、更优选地，将磁珠与甘露糖结合凝集素按照(3～4)×108磁珠/100μg甘露糖结合凝集素的比例混合；

10、和/或，所述孵育为在30～40℃下孵育18～30h；

11、优选地，所述孵育为在35～38℃下孵育22～26h；

12、更优选地，所述孵育为在旋转培养混合器中孵育；

13、和/或，所述磁珠为环氧树脂磁珠；

14、优选地，所述磁珠为dynabeadstmm-270epoxy环氧树脂磁珠。

15、本发明的第三个方面提供了一种富集呼吸道样本中的微生物的方法，其包括以下步骤：

16、1)将呼吸道样本与上述磁珠-甘露糖结合凝集素复合物混合后，孵育；

17、2)洗脱磁珠-甘露糖结合凝集素复合物表面富集的微生物，得到富集后的呼吸道样本。

18、在本发明的优选的实施方案中，所述呼吸道样本为新鲜采集的咽拭子。

19、在本发明的优选的实施方案中，所述孵育为在30～40℃下孵育0.5～2h；

20、优选地，所述孵育为在35～38℃下孵育0.7～1.5h；

21、所述孵育为在旋转培养混合器中孵育；

22、和/或，所述洗脱的过程为：无菌条件下先使用pbs缓冲液清洗磁珠-甘露糖结合凝集素复合物，清洗2～5次后，然后用0.05～0.2m柠檬酸盐溶液清洗磁珠-甘露糖结合凝集素复合物。

23、本发明的第四个方面提供了一种对呼吸道样本进行宏基因组测序的方法，其包括以下步骤：

24、1)将呼吸道样本与上述磁珠-甘露糖结合凝集素复合物混合后，孵育；

25、2)洗脱磁珠-甘露糖结合凝集素复合物表面富集的微生物，得到富集后的呼吸道样本；

26、3)提取富集后的呼吸道样本中的dna；

27、4)构建illumina测序文库，进行宏基因组测序。

28、在本发明的优选的实施方案中，所述呼吸道样本是新鲜采集的咽拭子。

29、在本发明的优选的实施方案中，所述提取富集后的呼吸道样本中的dna的过程为：先向富集后的呼吸道样本加入zr bashingbead裂解细菌细胞壁，之后利用minimag磁珠法对裂解后的样本进行dna提取；

30、和/或，利用trueprep flexible dna library prep kit for illumina构建illumina测序文库。

31、本发明的有益效果为：

32、(1)本发明的磁珠-甘露糖结合凝集素复合物在宿主细胞背景下，对呼吸道微生物有较高的富集效率。

33、(2)本发明利用活化环氧树脂磁珠表面携带的环氧基团，直接与甘露糖结合凝集素的伯氨基进行共价结合，实现磁珠-甘露糖结合凝集素复合物的快速制备。该构建方法无需预先对mbl蛋白进行工程化改造，制备方式快速简便。

34、(3)本发明将构建的磁珠-甘露糖结合凝集素复合物应用于呼吸道微生物的富集，并首次与高通量测序技术联合应用。实验表明，利用构建的磁珠-甘露糖结合凝集素复合物富集呼吸道微生物的方法能够提高宏基因组测序数据中的呼吸道微生物基因片段的比例，显著提高样本中的微生物丰富度；利用构建的磁珠-甘露糖结合凝集素复合物富集呼吸道微生物的方法有助于提高宏基因组测序对环境中多重耐药菌的流行以及菌间耐药和毒力基因传播的实时监测，富集后测序能够提高咽拭子样本中极低丰度微生物的基因位点覆盖度，有助于相关基因功能及突变进行分析。

技术特征：

1.一种磁珠-甘露糖结合凝集素复合物，其中，磁珠与甘露糖结合凝集素通过-(ch2)3chohch2nh-基团连接。

2.根据权利要求1所述的磁珠-甘露糖结合凝集素复合物，其中，所述磁珠为环氧树脂磁珠；

3.一种构建磁珠-甘露糖结合凝集素复合物的方法，其中，将磁珠与甘露糖结合凝集素混合后，孵育。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，在磁珠的悬浮液中加入硫酸铵溶液和甘露糖结合凝集素蛋白液，混合后，孵育；

5.一种富集呼吸道样本中的微生物的方法，其包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述呼吸道样本为新鲜采集的咽拭子。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述孵育为在30～40℃下孵育0.5～2h；

8.一种对呼吸道样本进行宏基因组测序的方法，其包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述呼吸道样本是新鲜采集的咽拭子。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述提取富集后的呼吸道样本中的dna的过程为：先向富集后的呼吸道样本加入zr bashingbead裂解细菌细胞壁，之后利用minimag磁珠法对裂解后的样本进行dna提取；

技术总结
本发明涉及一种磁珠‑甘露糖结合凝集素复合物、构建方法及其应用。本发明提供给了一种磁珠‑甘露糖结合凝集素复合物，其中，磁珠与甘露糖结合凝集素通过‑(CH<subgt;2</subgt;)<subgt;3</subgt;CHOHCH<subgt;2</subgt;NH‑基团连接。本发明提供了一种构建磁珠‑甘露糖结合凝集素复合物的方法，其中，将磁珠与甘露糖结合凝集素混合后，孵育。本发明的磁珠‑甘露糖结合凝集素复合物对呼吸道样本中的微生物具有较高的富集效率，从而能够降低测序结果中的宿主背景影响，提高呼吸道微生物的测序数据丰度。

技术研发人员：王健伟,任丽丽,吴明琨,黄鹤,肖艳,吴超
受保护的技术使用者：中国医学科学院病原生物学研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5