一种外膜蛋白F介导的细菌仿生囊泡及其制备方法和应用

本发明属于生物，特别涉及一种外膜蛋白f介导的细菌仿生囊泡及其制备方法和应用。

背景技术：

1、肿瘤是目前危害人类健康的主要疾病之一。除了手术与放化疗等常规治疗手段，肿瘤免疫疗法已成为极具潜力的重要临床策略之一，如单克隆抗体药物、细胞因子疗法、免疫检查点阻断(icb)、嵌合抗原受体t细胞(car-t)，以及癌症疫苗等都在临床治疗或临床前策略探讨中表现出各自引人瞩目的前景。

2、肿瘤疫苗旨在利用机体本身的免疫系统，激发肿瘤特异免疫效应，其通过将肿瘤抗原递送至抗原呈递细胞(apc)来刺激肿瘤特异性免疫效应细胞和免疫记忆细胞产生，以有效抑制肿瘤生长、复发和转移。肿瘤疫苗的一个主要设计热点是如何将肿瘤抗原成功递送至特定抗原呈递细胞(apc)，刺激抗原高效摄取、溶酶体逃逸以及交叉递呈，从而促进细胞以mhc-i类途径呈递抗原，同时高效表达共刺激分子及促炎性细胞因子，实现对效应t细胞的有效激活。

3、细菌囊泡是新的疫苗抗原递送平台，其蛋白脂质囊膜结构、纳米大小粒径、自佐剂效应、可工程化修饰抗原及免疫调控分子等特点，揭示了其独特而强大的免疫激活能力。然而，抗原荷载量低，限制了其应用前景。

4、因此，如何进一步提高细菌囊泡的抗原荷载量、改善其激发抗肿瘤免疫应答的能力，是一个需要解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种外膜蛋白f介导的细菌仿生囊泡及其制备方法和应用，显著提高了抗原抗原在细菌仿生囊泡表面的荷载量，为基于细菌仿生囊泡的新型疫苗开发提供重要基础。

2、基于申请人团队前期的研究基础，利用高压均质技术，通过调整高压均质机合适的压力和间隙从而实现从细菌的菌体中挤出仿生囊泡(bbv)，该技术可以让囊泡的产量大幅增加，还能实现与膜锚定蛋白一起让相应的抗原锚定在囊泡上。通过clya、trx等蛋白可以不同程度地把肿瘤抗原或细胞因子牵引到bbv上。groel是一个伴侣蛋白，研究发现抗生素亚胺培南不仅会促进肺炎克雷伯菌外膜囊泡(omvs)释放，而且还会增加groel蛋白在omvs上呈递。因此发明人尝试在没有抗生素的情况下，比较groel在bbv和omv上的表达情况。并且比较了groel与clya、trx三者牵引肿瘤抗原到bbv表面的情况，发现groel较clya和trx并没有太大的优势。但是在这个过程中，发明人注意到bbv上35kda处有一个蛋白富集量很高的条带，我们猜想如果能利用其作为新的牵引蛋白，或许能大大提升肿瘤抗原在bbv上的呈递量。因此发明人把该条带质谱分析，发现其是细菌外膜蛋白f(ompf)，它是大肠杆菌中主要的外膜孔蛋白之一。基于此，发明人提供了本发明的如下方案。

3、为了实现本发明的目的，本发明第一方面提供了一种外膜蛋白f介导的细菌仿生囊泡的制备方法，包括以下步骤：

4、步骤1，重组质粒的构建、转化及重组蛋白表达：

5、将编码外膜蛋白ompf和肿瘤特异性抗原hpv16 e7的基因序列插入载体质粒中，得到重组质粒；将重组质粒转化到大肠杆菌中，并在培养基中培养，当菌液od600达到0.4～0.6时，加诱导剂来诱导重组蛋白ompf-e7表达，诱导结束后收集菌液；

6、步骤2，ompf-e7-bbv的制备：

7、将步骤1收集获得的菌液进行离心处理，弃上清，并将沉淀重悬于缓冲液中得到细菌悬液，通过高压均质处理所述细菌悬液，细菌经超高压强的驱动、挤过裂缝，形成携带重组蛋白的膜成分，高压均质后所得悬浮液在6000g下4℃下离心30min，产生的上清液在26000rpm下4℃离心30min，去除上清液后，用hbss缓冲液重悬沉淀，通过碘克沙醇密度梯度离心，得到纯化的ompf-e7-bbv。

8、进一步的，步骤1中重组质粒转化所用大肠杆菌为敲除自身ompf的大肠杆菌菌株。

9、本发明的第二方面提供了一种外膜蛋白f介导的细菌仿生囊泡，所述细菌仿生囊泡由如上述制备方法制备得到。

10、进一步的，所述细菌仿生囊泡的粒径范围为200nm～300nm，分散系数dpi为0.18～0.25；其中重组蛋白ompf-e7的荷载量达40％。

11、本发明的第三方面提供了所述外膜蛋白f介导的细菌仿生囊泡的应用，所述细菌仿生囊泡用于制备预防乳腺癌的疫苗药物中。

12、本发明相比现有技术的有益效果为：

13、1、本申请发现外膜蛋白ompf作为引导序列，实现了融合蛋白ompf-e7的高效表达；并且与clya、trx、groel介导的e7抗原膜定位相比，ompf可以显著增加肿瘤抗原在bbv表面的高效呈递(约占总蛋白的40％)，解决了细菌仿生囊泡抗原纳米递送平台抗原载量不足这一关键挑战，为基于细菌仿生囊泡的新型疫苗研发提供了重要基础；

14、2、本发明所构建的外膜蛋白f介导的细菌仿生囊泡ompf-e7-bbv改善了现有bbv激发抗肿瘤免疫应答的能力，能够有效抑制肿瘤生长；具体的：体外实验证实ompf-e7-bbv能够促进bmdcs表面共刺激分子cd80、cd86、mhci以及mhcii等的高表达，显著促进bmdcs成熟；ompf-e7-bbv与bmdcs共孵育后，囊泡显示了溶酶体逃逸能力，并且随着孵育时间的增加，逃逸出溶酶体的囊泡数量增多。肿瘤模型干预研究显示，ompf-e7-bbv显著抑制了肿瘤的生长，进一步的免疫细胞应答表明，抗原特异的cd8+、ifn-γ+效应细胞应答增强，而免疫抑制的mdscs(gr+cd11b+)应答减弱。

技术特征：

1.一种外膜蛋白f介导的细菌仿生囊泡的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中载体质粒为prsfduet-1，重组质粒ompf-e7-prsfduet-1转化的具体步骤包括：

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中重组蛋白ompf-e7表达的具体步骤包括：

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述高压均质处理是将细菌悬液通过高压均质机，循环3次，每次5分钟，压力为1200bar。

5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中重组质粒转化所用大肠杆菌为敲除自身ompf的大肠杆菌菌株。

6.一种外膜蛋白f介导的细菌仿生囊泡，其特征在于，所述细菌仿生囊泡由如权利要求1～5所述制备方法制备得到。

7.根据权利要求6所述的外膜蛋白f介导的细菌仿生囊泡，其特征在于，所述细菌仿生囊泡的粒径范围为200nm～300nm，分散系数dpi为0.18～0.25；其中重组蛋白ompf-e7的荷载量达40％。

8.如权利要求6或7所述外膜蛋白f介导的细菌仿生囊泡的应用，其特征在于，所述细菌仿生囊泡用于制备预防乳腺癌的疫苗药物中。

技术总结
本发明提供了一种外膜蛋白F介导的细菌仿生囊泡及其制备方法和应用，本发明利用基因工程手段在大肠杆菌中表达外膜蛋白OmpF与肿瘤特异性抗原HPV16E7的融合蛋白OmpF‑E7，通过高压匀质技术结合差速离心制备获得呈递融合蛋白的细菌仿生囊泡OmpF‑E7‑BBV。与ClyA、Trx、GroEL介导的E7抗原膜定位相比，OmpF可以显著增加肿瘤抗原在BBV表面的高效呈递，解决了细菌仿生囊泡抗原纳米递送平台抗原载量不足这一关键挑战。进一步实验证实，本发明所构建的外膜蛋白F介导的细菌仿生囊泡OmpF‑E7‑BBV改善了现有BBV抗原荷载量低的能力，而且能够有效抑制肿瘤生长，为细菌仿生囊泡的新型疫苗研发提供重要基础。

技术研发人员：马雁冰,胡永茂,杨英,郑鹏,龙琼
受保护的技术使用者：中国医学科学院医学生物学研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5