适合于基因工程、细胞工程和细胞药物的细胞及其制造方法与流程
本发明涉及适合于基因工程、细胞工程和细胞药物的细胞及其制造方法。
背景技术：
1、自从crispr/cas系统作为新的基因组编辑工具被报道以来，已经利用crispr/cas系统进行了各种研究(例如专利文献1)。在利用crispr/cas系统的基因组编辑中，cas9核酸酶将被指导rna靶标化的靶区域双链切割。已知双链切割后的dna可通过同源重组修复(homologous directed repair：hdr)或非同源末端连接修复(non-homologous end-joining repair：nhej)而进行修复。hdr中，通过将具有与靶区域的周边区域同源的序列的供体dna与crispr/cas系统一起导入细胞中，能够将任意序列整合到靶区域中。
2、使用基因组改造技术利用hdr同时且高效地改造2个以上等位基因的技术已被开发(例如专利文献2)。专利文献2中公开了能够在2个以上等位基因中同时且高效地诱发数百kb的大规模缺失的技术。
3、为了应对由主要组织相容性基因复合体的差异导致的受体对移植细胞的排斥反应的问题，开发了制造mhc i类的表达和功能缺失的细胞的技术(例如专利文献3)。专利文献3中提出了为了使mhc i类的表达和功能缺失而将β2微球蛋白(b2m)敲除的方案。
4、现有技术文献
5、专利文献
6、专利文献1：国际公开第2014/093661号
7、专利文献2：国际公开第2021/206054号
8、专利文献3：国际公开第2012/145384号
技术实现思路
1、mhc缺损细胞作为应对免疫排斥问题的有效手段正在被开发，其方法大致分为以下2种：通过破坏mhc以外的分子而使mhc的细胞表面表达丧失的方法、以及破坏mhc的任一分子的方法。但是，mhc基因座的重复序列极多，通过目前的序列解码技术来解码基因座是非常困难的。即使能够进行特定部分的改造，也难以分析出重复序列的其它部分是被维持还是也被改造。因此，就使mhc基因座的特定基因靶标化的技术而言，不能排除基因组中发生了无法预测的改造的可能性，难以利用到用于再生医疗等的细胞的制作中。与此相对，就通过破坏mhc以外的分子而使mhc的细胞表面表达丧失的方法而言，该被破坏的分子的作用(例如β2微球蛋白)不明，目前无法排除由于破坏而产生无法预测的问题的风险。
2、因此，本发明提供使mhc的含有特定区域的序列解码困难的重复序列的大的区域缺失、或者将其置换为可解码区域的同时使mhc的特定基因缺失的细胞。本发明还提供使用能够高效地改造2个以上等位基因并且能够改造较大区域的基因组改造方法制造该细胞的方法。所得到的细胞适合于移植用途，或者还适合于在细胞工程中的应用。
3、作为一例，本发明包括以下方式。
4、[1a]一种细胞(特别是人细胞)，其含有具有缺失的基因组dna(特别是人基因组dna)，上述缺失为包含分别位于1个以上(优选为全部)染色体区域中的hla相似序列聚集区域的一部分或整体的区域(优选为包含整体的区域的缺失)的缺失，上述1个以上(优选为全部)染色体区域选自由以下(i)～(iv)中规定的染色体区域组成的组：
5、(i)含有hla-f、hla-g和hla-a的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：29723464-29945455、优选chr6：29723464-30010618、例如chr6：29722775-29945870或chr6：29711000-30020000的染色体区域对应的染色体区域)；
6、(ii)含有hla-c和hla-b的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：31269169-31357158、优选hg38基因组序列的chr6：31269169-31463338、例如chr6：31268749-31357179或chr6：31176000-31534000对应的染色体区域)；
7、(iii)含有hla-dra、hla-drb5和hla-drb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：32445000-32816951、优选chr6：32439951-32817002的染色体区域对应的染色体区域)；以及
8、(iv)含有hla-doa、hla-dpa1和hla-dpb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：33006838-33086238、优选chr6：33006838-33131199、例如chr6：32934636-33089696或chr6：33002000-33147000的染色体区域对应的染色体区域)，
9、上述hla相似序列聚集区域含有分别包含于上述染色体区域中的hla编码基因和hla相似序列的全部，
10、上述一部分含有至少一个连续(一つながり)的区域，上述一个连续的区域含有选自由分别包含于上述区域的hla编码基因和hla相似序列组成的组中的基因的50％以上。
11、[2a]根据上述[1a]所述的细胞，其中，上述基因组dna中，权利要求1中规定的具有缺失的(i)～(iv)中的任意一者或优选全部不含有或者仅含有1个内源性的hla和hla相似序列。
12、[3a]根据上述[1a]或[2a]所述的细胞，其中，上述基因组dna中，权利要求1中规定的具有缺失的(i)～(iv)中的任意一者或优选全部不含有内源性的hla和hla相似序列。
13、[4a]根据上述[1a]～[3a]中任一项所述的细胞，其具有(i)含有hla-f、hla-g和hla-a的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：29723464-29945455、优选chr6：29723464-30010618、例如chr6：29722775-29945870或chr6：29711000-30020000对应的染色体区域)中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
14、[5a]根据上述[1a]～[4a]中任一项所述的细胞，其具有(ii)含有hla-c和hla-b的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：31269169-31357158、优选hg38基因组序列的chr6：31269169-31463338、例如chr6：31268749-31357179或chr6：31176000-31534000对应的染色体区域)含有hla-c和hla-b的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：31269169-31357158、优选hg38基因组序列的chr6：31269169-31463338、例如chr6：31268749-31357179或chr6：31176000-31534000对应的染色体区域)中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
15、[6a]根据上述[1a]～[5a]中任一项所述的细胞，其具有(iii)含有hla-dra、hla-drb5和hla-drb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：32445000-32816951、优选chr6：32439951-32817002的染色体区域对应的染色体区域)或者与chr6：32445000-32821000对应的染色体区域中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
16、[7a]根据上述[1a]～[6a]中任一项所述的细胞，其具有(iv)含有hla-doa、hla-dpa1和hla-dpb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：33006838-33086238、优选chr6：33006838-33131199、例如chr6：32934636-33089696或chr6：33002000-33147000的染色体区域对应的染色体区域)中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
17、[8a]根据上述[1a]～[7a]中任一项所述的细胞，其中，上述缺失为与hg38基因组序列的chr6：29701000～29723464(例如chr6：29709000-29711000)对应的染色体区域中的特有序列(第1序列)中具有一端、并且与hg38基因组序列的chr6：29945455-30030000(例如chr6：30020000-30020000和chr6：30021500-30022800)对应的染色体区域中的特有序列(第2序列)中具有另一端的区域的缺失。
18、[9a]根据上述[1a]～[8a]中任一项所述的细胞，其中，上述基因组dna包含以可操作方式连接于控制序列的内源性或外源性的期望基因的插入，该插入位于上述(i)～(iv)中的任一区域内或者上述(i)～(iv)的区域以外的区域。
19、[10a]根据上述[1a]～[9a]中任一项所述的细胞，其中，上述缺失为与hg38基因组序列的chr6：31166000～31269169(例如chr6：31174000～31177000)对应的染色体区域中的特有序列(第3序列)中具有一端、并且与hg38基因组序列的chr6：31357158～31544000(例如chr6：31534000～31538000)对应的染色体区域中的特有序列(第4序列)中具有另一端的区域的缺失。
20、[11a]根据上述[1a]～[10a]中任一项所述的细胞，其中，上述缺失为与hg38基因组序列的chr6：32416000～33445000(例如chr6：32440000～32448500)对应的染色体区域中的特有序列(第5序列)中具有一端、并且与hg38基因组序列的chr6：32439951-32831000(例如chr6：32820500～32822500)对应的染色体区域中的特有序列(第6序列)中具有另一端的区域的缺失。
21、[12a]根据上述[1a]～[11a]中任一项所述的细胞，其中，上述缺失为与hg38基因组序列的chr6：32924000～33006838(例如chr6：32999500～33002500)对应的染色体区域中的特有序列(第7序列)中具有一端、并且与hg38基因组序列的chr6：33086238-33165000(例如chr6：33147500～33150500)对应的染色体区域中的特有序列(第8序列)中具有另一端的区域的缺失。
22、[13a]根据上述[1a]～[12a]中任一项所述的细胞，其中，具有缺失的上述(i)～(iv)在其染色体区域内不具有重复序列。
23、[14a]根据上述[1a]～[13a]中任一项所述的细胞，其具有功能性β2微球蛋白和功能性ciita中的任意一者或两者。
24、[15a]根据上述[1a]～[14a]中任一项所述的细胞，其中，细胞表面实质上不表达hla i类和/或hla ii类。
25、[16a]根据上述[1a]～[15a]中任一项所述的细胞，其中，缺失为100kb至400kb的大小。
26、[17a]一种组合物，其含有上述[1a]～[16a]中任一项所述的细胞。
27、[18a]一种细胞，其含有具有缺失的基因组，所述缺失为基因组的全部等位基因(2倍体的情况下为2个等位基因)中的区域的缺失(例如，1mb以内或500kb以内的区域的缺失)，并且所述缺失包含编码mhc分子的基因座的含有mhc相似序列聚集区域的一部分或优选全部的区域。
28、[19a]根据上述[18a]所述的细胞，其中，各mhc相似序列聚集区域中仅含有1个以下的编码mhc分子的基因。
29、[20a]根据上述[18a]所述的细胞，其中，各mhc相似序列聚集区域中仅含有4个以下的编码mhc分子的基因。
30、[21a]根据上述[18a]所述的细胞，其中，各mhc相似序列聚集区域中不含编码mhc分子的基因。
31、[22a]根据上述[18a]所述的细胞，其中，缺失为包含编码mhc分子的基因座的含有全部mhc相似序列聚集区域的区域的缺失。
32、[23a]根据上述[22a]所述的细胞，其还含有控制序列和以可操作方式连接于该控制序列的期望基因。
33、[24a]根据上述[23a]所述的细胞，其中，控制序列和以可操作方式连接于该控制序列的期望基因具有整体上天然不存在的序列。
34、[25a]根据上述[23a]所述的细胞，其中，控制序列和以可操作方式连接于该控制序列的期望基因具有天然存在的(或内源性的)序列。
35、[1b]一种细胞，其含有具有缺失的基因组dna，上述缺失为包含分别位于1个以上(优选为全部)染色体区域中的hla相似序列聚集区域的一部分或整体的区域的缺失(优选为包含整体的区域的缺失)，上述1个以上(优选为全部)染色体区域选自由以下(i)～(iv)中规定的染色体区域组成的组：
36、(i)含有hla-f、hla-g和hla-a的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：29723464-29945455、优选chr6：29723464-30010618、例如chr6：29722775-29945870或chr6：29711000-30020000的染色体区域对应的染色体区域)；
37、(ii)含有hla-c和hla-b的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：31269169-31357158、优选hg38基因组序列的chr6：31269169-31463338、例如chr6：31268749-31357179或chr6：31176000-31534000对应的染色体区域)；
38、(iii)含有hla-dra、hla-drb5和hla-drb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：32445000-32816951、优选chr6：32439951-32817002的染色体区域对应的染色体区域)；以及
39、(iv)含有hla-doa、hla-dpa1和hla-dpb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：33006838-33086238、优选chr6：33006838-33131199、例如chr6：32934636-33089696或chr6：33002000-33147000的染色体区域对应的染色体区域)，
40、上述hla相似序列聚集区域含有分别包含于上述染色体区域中的hla编码基因和hla相似序列的全部，
41、上述一部分含有至少一个连续的区域，上述一个连续的区域含有选自由分别包含于上述区域的hla编码基因和hla相似序列组成的组中的基因的50％以上。
42、[2b]根据上述[1b]所述的细胞，其中，上述基因组dna中，权利要求1中规定的具有缺失的(i)～(iv)中的任意一者或全部不含有或者仅含有1个内源性的hla和hla相似序列。
43、[3b]根据上述[1b]或[2b]所述的细胞，其中，上述基因组dna中，权利要求1中规定的具有缺失的(i)～(iv)中的任意一者或全部不含有内源性的hla和hla相似序列。
44、[4b]根据上述[1b]～[3b]中任一项所述的细胞，其具有(i)含有hla-f、hla-g和hla-a的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：29723464-29945455、优选chr6：29723464-30010618、例如chr6：29722775-29945870或chr6：29711000-30020000对应的染色体区域)中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
45、[5b]根据上述[1b]～[4b]中任一项所述的细胞，其具有(ii)含有hla-c和hla-b的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：31269169-31357158、优选hg38基因组序列的chr6：31269169-31463338、例如chr6：31268749-31357179或chr6：31176000-31534000对应的染色体区域)含有hla-c和hla-b的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：31269169-31357158、优选hg38基因组序列的chr6：31269169-31463338、例如chr6：31268749-31357179或chr6：31176000-31534000对应的染色体区域)中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
46、[6b]根据上述[1b]～[5b]中任一项所述的细胞，其具有(iii)含有hla-dra、hla-drb5和hla-drb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：32445000-32816951、优选chr6：32439951-32817002的染色体区域对应的染色体区域)或者与chr6：32445000-32821000对应的染色体区域中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
47、[7b]根据上述[1b]～[6b]中任一项所述的细胞，其具有(iv)含有hla-doa、hla-dpa1和hla-dpb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：33006838-33086238、优选chr6：33006838-33131199、例如chr6：32934636-33089696或chr6：33002000-33147000的染色体区域对应的染色体区域)中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
48、[8b]根据上述[1b]～[7b]中任一项所述的细胞，其中，上述缺失为与hg38基因组序列的chr6：29701000～29723464(例如chr6：29709000-29711000)对应的染色体区域中的特有序列(第1序列)中具有一端、并且与hg38基因组序列的chr6：29945455-30030000(例如chr6：30020000-30020000和chr6：30021500-30022800)对应的染色体区域中的特有序列(第2序列)中具有另一端的区域的缺失。
49、[9b]根据上述[1b]～[8b]中任一项所述的细胞，其中，上述基因组dna包含控制序列和以可操作方式连接于控制序列的内源性或外源性的期望基因的插入，该插入位于上述(i)～(iv)中的任一区域内或者上述(i)～(iv)的区域以外的区域。
50、[10b]根据上述[1b]～[9b]中任一项所述的细胞，其中，上述缺失为与hg38基因组序列的chr6：31166000～31269169(例如chr6：31174000～31177000)对应的染色体区域中的特有序列(第3序列)中具有一端、并且与hg38基因组序列的chr6：31357158～31544000(例如chr6：31534000～31538000)对应的染色体区域中的特有序列(第4序列)中具有另一端的区域的缺失。
51、[11b]根据上述[1b]～[10b]中任一项所述的细胞，其中，上述缺失为与hg38基因组序列的chr6：32416000～33445000(例如chr6：32440000～32448500)对应的染色体区域中的特有序列(第5序列)中具有一端、并且与hg38基因组序列的chr6：32439951-32831000(例如chr6：32820500～32822500)对应的染色体区域中的特有序列(第6序列)中具有另一端的区域的缺失。
52、[12b]根据上述[1b]～[11b]中任一项所述的细胞，其中，上述缺失为与hg38基因组序列的chr6：32924000～33006838(例如chr6：32999500～33002500)对应的染色体区域中的特有序列(第7序列)中具有一端、并且与hg38基因组序列的chr6：33086238-33165000(例如chr6：33147500～33150500)对应的染色体区域中的特有序列(第8序列)中具有另一端的区域的缺失。
53、[13b]根据上述[1b]～[12b]中任一项所述的细胞，其中，具有缺失的上述(i)～(iv)在其染色体区域内不具有重复序列。
54、[14b]根据上述[1b]～[13b]中任一项所述的细胞，其具有功能性β2微球蛋白和功能性ciita中的任意一者或两者。
55、[15b]根据上述[1b]～[14b]中任一项所述的细胞，其中，细胞表面实质上不表达hla i类和/或hla ii类。
56、[16b]根据上述[1b]～[15b]中任一项所述的细胞，其中，缺失为100kb至400kb的大小。
57、[17b]一种组合物，其含有上述[1b]～[16b]中任一项所述的细胞。
58、[1c]一种细胞，其含有具有缺失的基因组dna，上述缺失为包含分别位于选自由以下(i)～(iv)中规定的染色体区域组成的组中的1个以上(优选为全部)染色体区域中的hla相似序列聚集区域整体的区域的缺失：
59、(i)含有hla-f、hla-g和hla-a的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：29723464-29945455、优选chr6：29723464-30010618、例如chr6：29722775-29945870或chr6：29711000-30020000的染色体区域对应的染色体区域)；
60、(ii)含有hla-c和hla-b的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：31269169-31357158、优选hg38基因组序列的chr6：31269169-31463338、例如chr6：31268749-31357179或chr6：31176000-31534000对应的染色体区域)；
61、(iii)含有hla-dra、hla-drb5和hla-drb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：32445000-32816951、优选chr6：32439951-32817002的染色体区域对应的染色体区域)；以及
62、(iv)含有hla-doa、hla-dpa1和hla-dpb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：33006838-33086238、优选chr6：33006838-33131199、例如chr6：32934636-33089696或chr6：33002000-33147000的染色体区域对应的染色体区域)，
63、上述hla相似序列聚集区域含有分别包含于上述染色体区域中的hla编码基因和hla相似序列的全部，
64、基因组dna可以还包含编码hla-e的基因的缺失，
65、具有缺失的区域中的任一者(例如具有编码hla-e的基因的缺失的区域)具有第1等位基因和第2等位基因，上述第1等位基因和第2等位基因分别在该缺失位点具有包含含有用于负选择的选择标记基因(和优选用于正选择的标记基因)的1个以上选择标记基因的碱基序列的盒(分别称为第1盒和第2盒)，第1盒中所含的用于负选择的选择标记基因与第2盒中所含的1个以上用于负选择的选择标记基因是相互能够区分的不同的，由此，将第1盒或第2盒进一步供于除去或置换为其它序列的改造后，能够以上述第1盒或第2盒中所含的用于负选择的选择标记基因不表达为指标选择出上述第1盒或第2盒中具有改造的细胞。
66、[2c]一种细胞，其含有具有缺失的基因组dna，上述缺失为包含分别位于选自由以下(i)～(iv)中规定的染色体区域组成的组中的1个以上(优选为全部)染色体区域中的hla相似序列聚集区域整体的区域的缺失：
67、(i)含有hla-f、hla-g和hla-a的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：29723464-29945455、优选chr6：29723464-30010618、例如chr6：29722775-29945870或chr6：29711000-30020000的染色体区域对应的染色体区域)；
68、(ii)含有hla-c和hla-b的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：31269169-31357158、优选hg38基因组序列的chr6：31269169-31463338、例如chr6：31268749-31357179或chr6：31176000-31534000对应的染色体区域)；
69、(iii)含有hla-dra、hla-drb5和hla-drb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：32445000-32816951、优选chr6：32439951-32817002的染色体区域对应的染色体区域)；以及
70、(iv)含有hla-doa、hla-dpa1和hla-dpb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：33006838-33086238、优选chr6：33006838-33131199、例如chr6：32934636-33089696或chr6：33002000-33147000的染色体区域对应的染色体区域)，
71、上述hla相似序列聚集区域含有分别包含于上述染色体区域中的hla编码基因和hla相似序列的全部，
72、基因组dna还包含编码hla-e的基因的缺失，
73、具有缺失的区域中的任一者(例如具有编码hla-e的基因的缺失的区域)具有第1等位基因和第2等位基因，上述第1等位基因具有外源的目标基因，第2等位基因在该缺失位点具有包含含有用于负选择的选择标记基因(和优选用于正选择的标记基因)的1个以上选择标记基因的碱基序列的盒(称为第2盒)，由此，将第2盒进一步供于除去或置换为其它序列的改造后，能够以上述第2盒中所含的用于负选择的选择标记基因不表达为指标选择出上述第2盒中具有改造的细胞。
74、[3c]一种细胞，其含有具有缺失的基因组dna，上述缺失为包含分别位于选自由以下(i)～(iv)中规定的染色体区域组成的组中的1个以上(优选为全部)染色体区域中的hla相似序列聚集区域整体的区域的缺失：
75、(i)含有hla-f、hla-g和hla-a的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：29723464-29945455、优选chr6：29723464-30010618、例如chr6：29722775-29945870或chr6：29711000-30020000的染色体区域对应的染色体区域)；
76、(ii)含有hla-c和hla-b的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：31269169-31357158、优选hg38基因组序列的chr6：31269169-31463338、例如chr6：31268749-31357179或chr6：31176000-31534000对应的染色体区域)；
77、(iii)含有hla-dra、hla-drb5和hla-drb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：32445000-32816951、优选chr6：32439951-32817002的染色体区域对应的染色体区域)；以及
78、(iv)含有hla-doa、hla-dpa1和hla-dpb1的一连串区域(例如，与hg38基因组序列的chr6：33006838-33086238、优选chr6：33006838-33131199、例如chr6：32934636-33089696或chr6：33002000-33147000的染色体区域对应的染色体区域)，
79、上述hla相似序列聚集区域含有分别包含于上述染色体区域中的hla编码基因和hla相似序列的全部，
80、基因组dna还包含编码hla-e的基因的缺失，
81、具有缺失的区域中的任一者(例如具有编码hla-e的基因的缺失的区域)具有第1等位基因和第2等位基因，并且，
82、(1)上述第1等位基因和第2等位基因的缺失位点分别具有外源的目标基因、或者
83、(2)第1等位基因和第2等位基因的缺失位点中的任一者具有外源的目标基因、并且另一者具有缺失位点的两端直接或间接地(例如通过间隔子等间接地)连接而成的结构。
84、[4c]根据上述[2c]所述的细胞，其中，第1等位基因含有编码选自由hla-a、hla-b、hla-c和hla-e组成的组中的任意1个、2个、3个或全部的外源基因。
85、[5c]根据上述[3c]所述的细胞，其中，外源的目标基因含有编码选自由hla-a、hla-b、hla-c和hla-e组成的组中的任意1个、2个、3个或全部的外源基因，外源的目标基因分别包含于第1等位基因或第2等位基因中。
86、[6c]根据上述[2c]或[4c]所述的细胞，其中，上述外源基因分别还含有该基因的编码区域的转录起始点的上游序列、内含子和终止密码子的下游序列。
87、[7c]根据上述[3c]或[5c]所述的细胞，其中，上述外源基因分别还含有该基因的编码区域的转录起始点的上游序列、内含子和终止密码子的下游序列。
88、[8c]根据上述[6c]所述的细胞，其中，上述上游序列具有1kbp以上的长度。
89、[9c]根据上述[7c]所述的细胞，其中，上述上游序列具有1kbp以上的长度。
90、[10c]一种组合物，其含有上述[1c]～[9c]中任一项所述的细胞。
91、[11c]一种用于分析上述外源基因的表达和/或功能的组合物，其含有上述[2c]～[9c]中任一项所述的细胞。
92、作为一例，本发明包括以下方式。
93、[1]一种基因组改造方法，其是在mhc基因座中改造染色体基因组的2个以上等位基因的基因组改造方法(特别是通过改造染色体基因组的2个以上等位基因而使特定基因群缺失的方法)，包括：
94、(a)将下述(i)和(ii)导入含有上述染色体的细胞中的步骤，
95、(i)基因组改造系统，其含有以上述染色体基因组的靶区域为靶标的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
96、(ii)2种以上选择标记用供体dna，其在具有与上述靶区域的上游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的上游同源臂与具有与上述靶区域的下游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的下游同源臂之间含有选择标记基因的碱基序列，上述2种以上选择标记用供体dna具有相互不同的选择标记基因，上述选择标记用供体dna的种类数大于等于作为基因组改造对象的上述等位基因的数量；以及
97、(b)在上述步骤(a)之后基于上述2种以上选择标记用供体dna所具有的全部选择标记基因选择出上述细胞的步骤。
98、[2]根据[1]所述的基因组改造方法，其中，上述选择标记基因为正选择标记基因，上述步骤(b)为选择出表达与上述等位基因的数量相等的上述正选择标记基因的细胞的步骤。
99、[3]根据[2]所述的基因组改造方法，其中，上述选择标记用供体dna在上述上游同源臂与上述下游同源臂之间还具有负选择标记基因。
100、[4]根据[3]所述的基因组改造方法，其还包括：(c)在上述步骤(b)之后将在具有与上述靶区域的上游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的上游同源臂与具有与上述靶区域的下游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的下游同源臂之间含有期望的碱基序列的重组用供体dna导入上述细胞中的步骤；以及(d)在上述步骤(c)之后选择出不表达上述负选择标记基因的细胞的步骤。
101、[5]根据[3]或[4]所述的基因组改造方法，其中，上述正选择标记基因为抗药性基因，上述负选择标记基因为荧光蛋白基因。
102、[6]根据[1]～[5]中任一项所述的基因组改造方法，其中，上述序列特异性核酸切割分子为序列特异性核酸内切酶。
103、[7]根据[6]所述的基因组改造方法，其中，上述基因组改造系统含有cas蛋白和具有与上述靶区域内的碱基序列同源的碱基序列的指导rna。
104、[8]一种改造染色体基因组的2个以上等位基因的基因组改造试剂盒，其含有下述(i)和(ii)：
105、(i)基因组改造系统，其含有以上述染色体基因组的靶区域为靶标的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸；
106、(ii)2种以上选择标记用供体dna，其在具有与上述靶区域的上游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的上游同源臂与具有与上述靶区域的下游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的下游同源臂之间含有选择标记基因的碱基序列，上述2种以上选择标记用供体dna具有相互不同的选择标记基因，上述选择标记用供体dna的种类数大于等于作为基因组改造对象的上述等位基因的数量。
107、[9]根据[8]所述的基因组改造试剂盒，其中，上述选择标记基因为正选择标记基因。
108、[10]根据[9]所述的基因组改造试剂盒，其中，上述选择标记用供体dna在上述上游同源臂与上述下游同源臂之间还具有负选择标记基因。
109、[11]根据[8]～[10]中任一项所述的基因组改造试剂盒，其中，上述序列特异性核酸切割分子为序列特异性核酸内切酶。
110、[12]根据[8]～[11]中任一项所述的基因组改造试剂盒，其中，上述基因组改造系统含有cas蛋白和具有与上述靶区域内的碱基序列同源的碱基序列的指导rna。
111、作为一例，本发明包括以下方式。
112、〔1〕一种制作染色体基因组的2个以上等位基因被改造了的细胞的方法，其包括：
113、(a)将下述(i)和(ii)导入含有2个以上等位基因的细胞中而向上述2个以上等位基因分别导入选择标记基因的步骤，
114、(i)基因组改造系统，其含有能够以上述染色体基因组的2个以上等位基因中的靶区域为靶标并且切割该靶区域的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
115、(ii)2种以上选择标记用供体dna，其分别具备具有能够与上述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与上述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂，并且在上游同源臂与下游同源臂之间含有选择标记基因的碱基序列，上述2种以上选择标记用供体dna分别具有相互能够区分的不同的选择标记基因，上述选择标记基因是每种选择标记用供体dna所特有的，上述选择标记用供体dna的种类数大于等于作为基因组改造对象的上述等位基因的数量；以及
116、(b)在上述步骤(a)之后通过使不同种类的选择标记用供体dna分别对上述2个以上等位基因进行同源重组而向该2个以上等位基因中分别导入能够区分的不同的特有的选择标记基因、并且选择出表达所有导入的该能够区分的不同的选择标记基因的细胞的步骤(用于正选择的步骤)。
117、〔2〕一种改造染色体基因组的2个以上等位基因的方法，其包括：
118、(a)将下述(i)和(ii)导入含有2个以上等位基因的细胞中而向上述2个以上等位基因中分别导入选择标记基因的步骤，
119、(i)基因组改造系统，其含有能够以上述染色体基因组的2个以上等位基因中的靶区域为靶标并且切割该靶区域的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
120、(ii)2种以上选择标记用供体dna，其分别具备具有能够与上述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与上述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂，并且在上游同源臂与下游同源臂之间含有选择标记基因的碱基序列，上述2种以上选择标记用供体dna分别具有相互能够区分的不同的选择标记基因，上述选择标记基因是每种选择标记用供体dna所特有的，上述选择标记用供体dna的种类数大于等于作为基因组改造对象的上述等位基因的数量；以及
121、(b)在上述步骤(a)之后通过使不同种类的选择标记用供体dna分别对上述2个以上等位基因进行同源重组而向该2个以上等位基因中分别导入能够区分的不同的特有的选择标记基因、并且选择出表达所有导入的该能够区分的不同的选择标记基因的细胞的步骤(用于正选择的步骤)。
122、〔3〕根据上述〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，靶区域具有5kbp以上的长度。
123、〔4〕根据上述〔3〕所述的方法，其中，靶区域具有8kbp以上的长度。
124、〔5〕根据上述〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其中，2种以上选择标记用供体dna分别在上述上游同源臂与上述下游同源臂之间具有用于正选择的选择标记基因、用于负选择的标记基因和靶序列，在此，在该选择标记基因既可以用于正选择也可以用于负选择的情况下，可以不具有其它的用于负选择的选择标记基因，
125、所述方法还包括：
126、(c)在上述步骤(b)之后将下述(iii)和(iv)导入所选择的细胞中而向上述2个以上等位基因中导入重组用供体dna的步骤，
127、(iii)基因组改造系统，其含有能够以上述靶序列为靶标并且切割该靶序列的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
128、(iv)含有期望的碱基序列的重组用供体dna，其具备具有能够与上述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与上述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂；以及
129、(d)在上述步骤(c)之后选择出不表达上述用于负选择的标记基因的细胞的步骤(用于负选择的步骤)。
130、〔6〕根据上述〔3〕所述的方法，其中，2种以上选择标记用供体dna分别在上述上游同源臂与上述下游同源臂之间具有用于正选择的选择标记基因、用于负选择的标记基因和靶序列，在此，在该选择标记基因既可以用于正选择也可以用于负选择的情况下，可以不具有其它的用于负选择的选择标记基因，
131、所述方法还包括：
132、(c)在上述步骤(b)之后将下述(iii)和(iv)导入所选择的细胞中而向上述2个以上等位基因中导入重组用供体dna的步骤，
133、(iii)基因组改造系统，其含有能够以上述靶序列为靶标并且切割该靶序列的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
134、(iv)含有期望的碱基序列的重组用供体dna，其具备具有能够与上述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与上述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂；以及
135、(d)在上述步骤(c)之后选择出不表达上述用于负选择的标记基因的细胞的步骤(用于负选择的步骤)。
136、〔7〕根据上述〔4〕所述的方法，其中，2种以上选择标记用供体dna分别在上述上游同源臂与上述下游同源臂之间具有用于正选择的选择标记基因、用于负选择的标记基因和靶序列，在此，在该选择标记基因既可以用于正选择也可以用于负选择的情况下，可以不具有其它的用于负选择的选择标记基因，
137、所述方法还包括：
138、(c)在上述步骤(b)之后将下述(iii)和(iv)导入所选择的细胞中而向上述2个以上等位基因中导入重组用供体dna的步骤，
139、(iii)基因组改造系统，其含有能够以上述靶序列为靶标并且切割该靶序列的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
140、(iv)含有期望的碱基序列的重组用供体dna，其具备具有能够与上述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与上述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂；以及
141、(d)在上述步骤(c)之后选择出不表达上述用于负选择的标记基因的细胞的步骤(用于负选择的步骤)。
142、〔8〕根据上述〔5〕～〔7〕中任一项所述的方法，其中，重组用供体dna的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有5kbp以上的长度。
143、〔9〕根据上述〔6〕或〔7〕所述的方法，其中，重组用供体dna的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有5kbp以上的长度。
144、〔10〕根据上述〔7〕所述的方法，其中，重组用供体dna的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有5kbp以上的长度。
145、〔11〕根据上述〔8〕所述的方法，其中，重组用供体dna的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有8kbp以上的长度。
146、〔12〕一种改造染色体基因组的2个以上等位基因的基因组改造试剂盒，其含有下述(i)和(ii)：
147、(i)基因组改造系统，其含有能够以上述染色体基因组的靶区域为靶标并且切割靶区域的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸；
148、(ii)2种以上选择标记用供体dna，其具备具有能够与上述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与上述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂，在上游同源臂与下游同源臂之间含有选择标记基因的碱基序列，上述2种以上选择标记用供体dna具有相互能够区分的不同的选择标记基因，上述选择标记基因是每种选择标记用供体dna所特有的，上述选择标记用供体dna的种类数大于等于作为基因组改造对象的上述等位基因的数量。
149、〔13〕根据上述〔12〕所述的试剂盒，其中，靶区域具有5kbp以上的长度。
150、〔14〕根据上述〔13〕所述的试剂盒，其中，靶区域具有8kbp以上的长度。
151、〔15〕根据上述〔12〕～〔14〕中任一项所述的试剂盒，其还含有重组用供体dna。
152、〔16〕根据上述〔12〕～〔15〕中任一项所述的试剂盒，其中，重组用供体dna的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有5kbp以上的长度。
153、〔17〕根据上述〔12〕～〔16〕中任一项所述的试剂盒，其中，重组用供体dna的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有8kbp以上的长度。
154、〔18〕根据上述〔12〕所述的试剂盒，其中，靶区域具有5kbp以上的长度，并且重组用供体dna的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有5kbp以上的长度。
155、〔19〕根据上述〔18〕所述的试剂盒，其中，靶区域具有8kbp以上的长度，并且重组用供体dna的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有8kbp以上的长度。
156、〔20〕根据上述〔5〕所述的方法，其中，重组用供体dna在重组用供体dna的上游同源臂与下游同源臂之间的区域不具有碱基序列，改造后得到的染色体基因组的上述2个以上等位基因中，靶区域的上游与下游的序列以没有碱基的插入、置换和缺失的方式无缝连接。
157、〔21〕根据上述〔6〕或〔7〕所述的方法，其中，重组用供体dna在重组用供体dna的上游同源臂与下游同源臂之间的区域不具有碱基序列，改造后得到的染色体基因组的上述2个以上等位基因中，靶区域的上游与下游的序列以没有碱基的插入、置换和缺失的方式无缝连接。
158、〔22〕根据上述〔3〕所述的方法，其中，改造后得到的染色体基因组的上述2个以上等位基因中不存在位点特异性重组酶的靶序列。
159、〔23〕根据上述〔4〕所述的方法，其中，改造后得到的染色体基因组的上述2个以上等位基因中不存在位点特异性重组酶的靶序列。
160、〔24〕根据上述〔5〕所述的方法，其中，改造后得到的染色体基因组的上述2个以上等位基因中不存在位点特异性重组酶的靶序列。
161、〔25〕根据上述〔6〕或〔7〕所述的方法，其中，改造后得到的染色体基因组的上述2个以上等位基因中不存在位点特异性重组酶的靶序列。
162、〔26〕根据上述〔1〕～〔11〕和〔20〕～〔25〕中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中，在直至选择出改造了2个以上等位基因的细胞为止的过程中，不进行单细胞克隆。
163、〔27〕一种细胞，其为关于靶区域在染色体基因组上具有2个以上等位基因的细胞，其中，上述2个以上等位基因各自的靶区域缺失，并且靶区域的上游与下游的序列以没有碱基的插入、置换和缺失的方式无缝连接。
164、〔28〕根据上述〔27〕所述的细胞，其中，靶区域具有5kbp以上的长度。
165、〔29〕根据上述〔27〕或〔28〕所述的细胞，其基因组中不具有位点特异性重组酶的靶序列。
166、〔30〕根据上述〔6〕或〔7〕所述的方法，其中，重组用供体dna的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有8kbp以上的长度。
167、〔31〕根据上述〔15〕所述的试剂盒，其中，重组用供体dna在重组用供体dna的上游同源臂与下游同源臂之间的区域不具有碱基序列。
168、作为一例，本发明包括以下方式。[1d]一种细胞(特别是人细胞)，其含有具有缺失的基因组dna(特别是人基因组dna)，上述缺失为包含分别位于选自由以下(i)～(iv)中规定的染色体区域组成的组中的1个以上染色体区域中的hla相似序列聚集区域的一部分或整体的区域的缺失：(i)与hg38基因组序列的chr6：29711000-30020000的染色体区域对应的染色体区域；(ii)与hg38基因组序列的chr6：31176000-31534000染色体区域对应的染色体区域；(iii)与hg38基因组序列的chr6：32445000-32821000染色体区域对应的染色体区域；以及(iv)与hg38基因组序列的chr6：33002000-33147000染色体区域对应的染色体区域，上述hla相似序列聚集区域含有分别包含于上述染色体区域中的hla编码基因和hla相似序列的全部，上述一部分含有至少一个连续的区域，上述一个连续的区域含有选自由分别包含于上述区域的hla编码基因和hla相似序列组成的组中的基因的50％以上。[2d]根据上述[1d]所述的细胞，其中，上述基因组dna中，权利要求1中规定的具有缺失的(i)～(iv)中的任意一者或优选全部不含有或者仅含有1个内源性的hla和hla相似序列。[3d]根据上述[1d]或[2d]所述的细胞，其中，上述基因组dna中，权利要求1中规定的具有缺失的(i)～(iv)中的任意一者或优选全部不含有内源性的hla和hla相似序列。[4d]根据上述[1d]～[3d]中任一项所述的细胞，其具有(i)chr6：29711000-30020000的染色体区域中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。[5d]根据上述[1d]～[4d]中任一项所述的细胞，其具有(ii)chr6：31176000-31534000的染色体区域中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。[6d]根据上述[1d]～[5d]中任一项所述的细胞，其具有(iii)chr6：32445000-32821000的染色体区域中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。[7d]根据上述[1d]～[6d]中任一项所述的细胞，其具有(iv)chr6：33002000-33147000的染色体区域中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。[8d]根据上述[1d]～[7d]中任一项所述的细胞，其中，上述缺失为chr6：29709000-29711000的染色体区域中的特有序列(第1序列)中具有一端、并且chr6：30020000-30020000的染色体区域和chr6：30021500-30022800的染色体区域中的特有序列(第2序列)中具有另一端的区域的缺失。[9d]根据上述[1d]～[8d]中任一项所述的细胞，其中，上述基因组dna包含以可操作方式连接于控制序列的内源性或外源性的期望的期望基因的插入，该插入位于上述(i)～(iv)中的任一区域内或者上述(i)～(iv)的区域以外的区域。[10d]根据上述[1d]～[9d]中任一项所述的细胞，其中，上述缺失为chr6：31174000～31177000的染色体区域中的特有序列(第3序列)中具有一端、并且chr6：31534000～31538000的染色体区域中的特有序列(第4序列)中具有另一端的区域的缺失。[11d]根据上述[1d]～[10d]中任一项所述的细胞，其中，上述缺失为chr6：32446000～32448500的染色体区域中的特有序列(第5序列)中具有一端、并且chr6：32820500～32822500的染色体区域中的特有序列(第6序列)中具有另一端的区域的缺失。[12d]根据上述[1d]～[11d]中任一项所述的细胞，其中，上述缺失为chr6：32999500～33002500的染色体区域中的特有序列(第7序列)中具有一端、并且chr6：33147500～33150500的染色体区域中的特有序列(第8序列)中具有另一端的区域的缺失。[13d]根据上述[1d]～[12d]中任一项所述的细胞，其中，具有缺失的上述(i)～(iv)在其染色体区域内不具有重复序列。[14d]根据上述[1d]～[13d]中任一项所述的细胞，其具有功能性β2微球蛋白和功能性ciita中的任意一者或两者。[15d]根据上述[1d]～[14d]中任一项所述的细胞，其中，细胞表面实质上不表达hla i类和/或hla ii类。[16d]根据上述[1d]～[15d]中任一项所述的细胞，其中，缺失为100kb至400kb的大小。[17d]一种组合物，其含有上述[1d]～[16d]中任一项所述的细胞。[18d]一种细胞，其含有具有缺失的基因组，所述缺失为基因组的全部等位基因(2倍体的情况下为2个等位基因)中的区域的缺失(例如，1mb以内或500kb以内的区域的缺失)，并且所述缺失包含编码mhc分子的基因座的含有mhc相似序列聚集区域的一部分或优选全部的区域。[19d]根据上述[18d]所述的细胞，其中，各mhc相似序列聚集区域中仅含有1个以下的编码mhc分子的基因。[20d]根据上述[18d]所述的细胞，其中，各mhc相似序列聚集区域中仅含有4个以下的编码mhc分子的基因。[21d]根据上述[18d]所述的细胞，其中，各mhc相似序列聚集区域中不含编码mhc分子的基因。[22d]根据上述[18d]所述的细胞，其中，缺失为包含编码mhc分子的基因座的含有全部mhc相似序列聚集区域的区域的缺失。[23d]根据上述[22d]所述的细胞，其中，还含有控制序列和以可操作方式连接于该控制序列的期望基因。[24d]根据上述[23d]所述的细胞，其中，控制序列和以可操作方式连接于该控制序列的期望基因具有整体上天然不存在的序列。[25d]根据上述[23d]所述的细胞，其中，控制序列和以可操作方式连接于该控制序列的期望基因具有天然存在的(或内源性的)序列。
169、发明效果
170、根据本发明，可以提供能够高效地改造2个以上等位基因、并且能够改造较大区域(特别是hla i类区域和hla ii类区域的大规模缺失)的基因组改造方法和上述基因组改造试剂盒以及具有上述改造的细胞。
171、图面的简单的说明
172、图1为hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域的基因图谱。hla基因所在的簇用箭头强调示出。
173、图2示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-a基因的相似序列的检索结果。
174、图3示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-b基因的相似序列的检索结果。
175、图4示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-c基因的相似序列的检索结果。
176、图5示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-e基因的相似序列的检索结果。
177、图6示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-f基因的相似序列的检索结果。
178、图7示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-g基因的相似序列的检索结果。
179、图8示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-h基因的相似序列的检索结果。
180、图9示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-j基因的相似序列的检索结果。
181、图10示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-w基因的相似序列的检索结果。
182、图11示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的mica基因的相似序列的检索结果。
183、图12示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的micb基因的相似序列的检索结果。
184、图13示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-dra基因的相似序列的检索结果。
185、图14示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-drb1基因的相似序列的检索结果。
186、图15示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-drb5基因的相似序列的检索结果。
187、图16示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-drb6基因的相似序列的检索结果。
188、图17示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-drb9基因的相似序列的检索结果。
189、图18示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-dqa1基因的相似序列的检索结果。
190、图19示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-dqa2基因的相似序列的检索结果。
191、图20示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-dqb1基因的相似序列的检索结果。
192、图21示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-dpa1基因的相似序列的检索结果。
193、图22示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-dpb1基因的相似序列的检索结果。
194、图23示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-dmb基因的相似序列的检索结果。
195、图24示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-doa基因的相似序列的检索结果。
196、图25示出hla i类区域和hla ii类区域所在的6号染色体区域中的hla-dob基因的相似序列的检索结果。
197、图26示出hla i类区域和hla ii类区域中的4个hla相似序列(序列)聚集区域(i)～(iv)的位置。
198、图27示出用于鉴定hla相似序列聚集区域(i)的端粒侧的末端候补的blat检索结果的一例。
199、图28示出用于鉴定hla相似序列聚集区域(i)的着丝粒侧的末端候补的blat检索结果的一例。
200、图29示出用于鉴定hla相似序列聚集区域(ii)的端粒侧的末端候补的blat检索结果的一例。
201、图30示出用于鉴定hla相似序列聚集区域(ii)的着丝粒侧的末端候补的blat检索结果的一例。
202、图31示出用于鉴定hla相似序列聚集区域(iii)的端粒侧的末端候补的blat检索结果的一例。
203、图32示出用于鉴定hla相似序列聚集区域(iii)的着丝粒侧的末端候补的blat检索结果的一例。
204、图33示出用于鉴定hla相似序列聚集区域(iv)的端粒侧的末端候补的blat检索结果的一例。
205、图34示出用于鉴定hla相似序列聚集区域(iv)的着丝粒侧的末端候补的blat检索结果的一例。
206、图35示出图27～图34的结果的汇总。
207、图36示出将含有hla-f、hla-g和hla-a的一连串区域的整体通过本发明的方法除去的方法的方案和其结果。
208、图37示出将含有hla-c和hla-b的一连串区域的整体通过本发明的方法除去的方法的方案和其结果。所得到的细胞缺失了hla-f、hla-g和hla-a、以及hla-c和hla-b。
209、图38为示出所得到的细胞的hla-a、hla-b和hla-c均为阴性的散点图(sitegram)。
210、图39示出所得到的细胞显示出与未改造的ips细胞同等的多能干细胞标志物的表达。
211、图40示出使hla-e区域进一步缺失的方法的方案和其结果。
212、图41示出使hla-e区域进一步缺失的方法的方案和其结果。
213、图42示出导入添加了信号序列的hla-e代替hla-e的方案和其结果。
214、图43示出还将含有hla-dra、hla-drbs、hla-dqas、hla-dqb1和hla-dob的一连串区域的整体通过本发明的方法除去的方法的方案和其结果。所得到的细胞缺失了hla-f、hla-g和hla-a；hla-c和hla-b；以及hla-dra、hla-drbs、hla-dqas、hla-dqb1和hla-dob。
215、图44为示出还将含有hla-dra、hla-drbs、hla-dqas、hla-dqb1和hla-dob的一连串区域的整体通过本发明的方法除去的方法的方案和其结果。所得到的细胞缺失了hla-f、hla-g和hla-a；hla-c和hla-b；以及hla-dra、hla-drbs、hla-dqas、hla-dqb1和hla-dob。
216、图45示出向具有hla-e缺失的区域导入任意的目标基因的方案。
217、图46示出对hla-e缺损位点导入外源基因(例如hla-a、hla-b、hla-c和hla-e)的方案。
218、图47示出对缺失了含有hla-f、hla-g和hla-a的一连串区域和含有hla-c和hla-b的一连串区域的细胞的hla-e用ukis标记置换而得到的细胞整合hla-a和b的方案和其结果。
219、图48示出对缺失了含有hla-f、hla-g和hla-a的一连串区域和含有hla-c和hla-b的一连串区域的细胞(参照图37)的hla-e用ukis标记置换而得到的细胞整合hla-c和e的方案和其结果。
220、图49示出重新导入了hla-a和b的细胞(参照图47)和重新导入了hla-c和e的细胞(参照图48)中的hla的细胞表面表达。
221、图50示出hla缺损细胞可避免t细胞的细胞杀伤。
技术特征：
1.一种细胞，其含有具有缺失的基因组dna，所述缺失为包含分别位于1个以上染色体区域中的hla相似序列聚集区域的一部分或整体的区域的缺失，所述1个以上染色体区域选自由以下(i)～(iv)中规定的染色体区域组成的组：
2.根据权利要求1所述的细胞，其中，所述基因组dna中，权利要求1中规定的具有缺失的(i)～(iv)中的任意一者或优选全部不含有或者仅含有1个内源性的hla和hla相似序列。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中，所述基因组dna中，权利要求1中规定的具有缺失的(i)～(iv)中的任意一者或优选全部不含有内源性的hla和hla相似序列。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞，其具有(i)含有hla-f、hla-g和hla-a的一连串区域中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞，其具有(ii)含有hla-c和hla-b的一连串区域中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞，其具有(iii)含有hla-dra、hla-drb5和hla-drb1的一连串区域或者与chr6：32445000-32821000对应的染色体区域中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞，其具有(iv)含有hla-doa、hla-dpa1和hla-dpb1的一连串区域中的hla相似序列聚集区域整体发生了缺失的基因组dna。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的细胞，其中，所述缺失为与hg38基因组序列的chr6：29701000～29723464对应的染色体区域中的特有序列(第2序列)中具有另一端的区域的缺失。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的细胞，其中，所述基因组dna包含以可操作方式连接于控制序列的内源性或外源性的期望基因的插入，该插入位于所述(i)～(iv)中的任一区域内或者所述(i)～(iv)的区域以外的区域。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的细胞，其中，所述缺失为与hg38基因组序列的chr6：31166000～31269169对应的染色体区域中的特有序列(第3序列)中具有一端、并且与hg38基因组序列的chr6：31357158～31544000对应的染色体区域中的特有序列(第4序列)中具有另一端的区域的缺失。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的细胞，其中，所述缺失为与hg38基因组序列的chr6：32416000～33445000对应的染色体区域中的特有序列(第5序列)中具有一端、并且与hg38基因组序列的chr6：32439951-32831000对应的染色体区域中的特有序列(第6序列)中具有另一端的区域的缺失。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的细胞，其中，所述缺失为与hg38基因组序列的chr6：32924000～33006838对应的染色体区域中的特有序列(第7序列)中具有一端、并且与hg38基因组序列的chr6：33086238-33165000对应的染色体区域中的特有序列(第8序列)中具有另一端的区域的缺失。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的细胞，其中，具有缺失的所述(i)～(iv)在其染色体区域内不具有重复序列。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的细胞，其具有功能性β2微球蛋白和功能性ciita中的任意一者或两者。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的细胞，其中，细胞表面实质上不表达hlai类和/或hlaii类。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的细胞，其中，缺失为100kb至400kb的大小。
17.一种组合物，其含有权利要求1～16中任一项所述的细胞。
18.一种细胞，其含有具有缺失的基因组，所述缺失为基因组的全部等位基因中的区域的缺失，并且所述缺失包含编码mhc分子的基因座的含有mhc相似序列聚集区域的一部分或优选全部的区域。
19.根据权利要求18所述的细胞，其中，各mhc相似序列聚集区域中仅含有1个以下的编码mhc分子的基因。
20.根据权利要求18所述的细胞，其中，各mhc相似序列聚集区域中仅含有4个以下的编码mhc分子的基因。
21.根据权利要求18所述的细胞，其中，各mhc相似序列聚集区域中不含编码mhc分子的基因。
22.根据权利要求18所述的细胞，其中，缺失为包含编码mhc分子的基因座的含有全部mhc相似序列聚集区域的区域的缺失。
23.根据权利要求22所述的细胞，其中，还含有控制序列和以可操作方式连接于该控制序列的期望基因。
24.根据权利要求23所述的细胞，其中，控制序列和以可操作方式连接于该控制序列的期望基因具有整体上天然不存在的序列。
25.根据权利要求23所述的细胞，其中，控制序列和以可操作方式连接于该控制序列的期望基因具有天然存在的序列。
技术总结
本发明提供适合于基因工程、细胞工程和细胞药物的细胞及其制造方法。本发明提供通过除去2个以上等位基因中存在于特定基因区域的重复序列而使该区域的基因打靶或序列解码变得容易的技术。
技术研发人员：相泽康则,大野知幸
受保护的技术使用者：株式会社标志融合
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5