优化植物基因表达的方法与流程

本发明总体上涉及改良植物性状的领域。更具体地，本发明涉及通过筛选植物中的基因元件文库并识别期望的性状表达水平来优化天然植物性状的表达。

背景技术：

1、具有改良性状的作物因产品产量和质量的提高而具有显著的经济影响。因此，增强对各种生物或非生物胁迫因素诸如除草剂、昆虫、疾病、极端高温和干旱的抗性是期望的且有利的特征，但目前的方法尚未全面解决这一问题。用于识别和改良性状的耗时方法(例如通过传统植物育种)以及伴随基因修饰(gmo)作物的基因工程的繁琐监管过程并不能提供完整、全面的解决方案。

2、例如，最需要解决的问题是杂草与作物一起生长，除草剂的使用伴随着对作物的均匀性和产量的干扰。由于非期望的杂草生长而导致的产量和质量损失以及控制杂草的成本，对作物生产产生了重大的经济影响。据估计，如果在作物生长过程中不注意田间杂草，产量损失将达到约50％。因此，迫切需要使用各种除草剂来解决这一问题。此外，抗除草剂杂草的快速增加给全球粮食安全带来了巨大挑战，因为它可以降低作物产量，造成相当大的损失。连同缺乏新型除草剂，种植抗除草剂作物成为控制杂草的有效策略，因为这可以降低作物的药害，并扩大除草剂的范围。

3、耐除草剂(ht)作物带来了好处，诸如减少使用量和引入现代且更安全的农用化学品的能力。

4、一些最常见的gmo作物(诸如玉米、大豆、棉花和油菜)携带ht基因(诸如bar或pat)，这些基因对谷氨酰胺合成抑制剂或基于草甘膦的除草剂(诸如roundup)具有耐受性，后者靶向5-烯醇丙酮莽草酸3-磷酸合酶(epsps)。roundup ready植物携带编码这种酶的草甘膦不敏感形式的基因，其从农杆菌属(agrobacterium sp.)的菌株cp4 epsps(roundup)获得，或其他抗性基因。

5、然而，针对ht的最先进的解决方案包括具有转化的内源基因的gmo作物，这种方法需要事先了解可以靶向或利用的性状相关基因。此外，过去几年公众对gmo技术的接受度下降，导致人们开始寻找新的且更环保的技术，诸如越来越难寻找的天然抗性。

6、在一些情况下，植物天然基因的天然抗性机制被证明是克服胁迫因素所需的效率。例如，植物天然基因的表达水平高于正常水平，而这些基因是除草剂的靶标，导致ht增加，因为高水平的天然酶克服除草剂，从而赋予抗性。

7、对于植物天然5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)的高表达水平，观察到这种天然抗性，导致杂草对epsps抑制剂型除草剂(诸如草甘膦)产生抗性。

8、因此，需要全面的解决方案来改善和优化植物的基因表达水平和/或表型。

技术实现思路

1、根据一些方面，本文提供了用于在模型植物中高通量评价作物植物的内源基因调控元件和/或作物植物的编码区的方法。每种可能性均是不同的实施方式。

2、评价包括筛选包含大量改变的基因元件集合(即，调控元件或编码区)的植物基因文库，这些改变的基因元件在功能上与提供表型性状的报告基因相关，从而有利地允许在植物内(in-planta)选择报告基因表达的期望变化并识别引入至调控元件或编码序列中的相关基因变化。

3、在一些实施方式中，该方法提供了对源自期望作物植物(例如，大豆、玉米、稻)的期望性状相关基因的大量改变的内源基因元件集合的高通量评估。

4、在一些实施方式中，使用标准分子生物学工具进行诱变，在体外生成大量改变的内源基因元件集合，有利地允许(i)以高精确度完全覆盖具有突变的元件和(ii)将该集合转化成不同类型的植物(即，“模型植物”，诸如拟南芥(arabidopsis))，其更易于操纵和筛选。

5、有利地，如有需要，进行体外诱变步骤使源自作物植物的基因元件与其编码序列解离/解偶联。

6、进一步有利的是改变的基因元件与报告基因(例如，除草剂耐受性、可视化基因(诸如gfp或类似基因))的功能关联/偶联，这提供了易于检测的表型性状，只需根据预先确定的临界浓度将除草剂施用于植物，和/或可视化标志物表达即可进行评估。

7、在一些示例性实施方式中，使用这种方法可以生成嵌合pgmppo1-atppox1基因(大豆(大豆(glycine max))ppo1启动子与拟南芥(拟南芥(a.thaliana))ppox1基因偶联)。

8、创建转基因模型植物，如拟南芥，携带源自作物植物的大量突变的基因元件集合，与易于筛选的标志物(诸如ht)并列，有利于大规模的植物内筛选和选择改善性状表达的基因变化。

9、在一些实施方式中，该方法能够高通量筛选性状的期望变化，而无需筛选单个作物植物中的突变。

10、在一些实施方式中，在识别最初源自期望作物植物并引入至模型植物中的基因元件中的基因变化之后，可以使用基因编辑方法生成基因修饰的作物植物，解决识别的相关突变。

11、因此，有利地，所公开的发明绕过了筛选作物植物的改善性状的突变的低效步骤。

12、在一些实施方式中，本公开的拟南芥植物相对于源自其他重要作物植物的改变的基因元件是转基因的。

13、在一些实施方式中，本公开的报告基因(例如，除草剂耐受性)允许评估活植物/有活力的植物中的优化水平。(即不需要进行染色测定或任何破坏植物的步骤)。

14、在一些实施方式中，将基因变化引入至转基因基因元件中，这些转基因基因元件是筛选的对象并且源自期望的靶作物植物。

15、对基因的调控元件序列引入变化(并且在某种程度上是其编码序列)可以导致基因表达模式发生改变/改善，然而，尚不清楚这些改变中的哪些将导致期望的表达模式以及如何发现这些改变，这组合起来可以代表待构建约10,118,250个不同序列并筛选1500bp的基因元件的问题。

16、为了克服或绕过这些限制，在一些实施方式中，本公开提供了一种方法，其有利地允许在拟南芥中筛选源自作物植物的数万至数百万个单独突变的基因元件。在一些实施方式中，使用拟南芥来携带来自作物植物的改变的基因元件允许应用在体外而不是在作物植物的细胞系统内进行的简单突变生成测定。

17、在一些实施方式中，本公开的方法包括体外诱变，从而允许任何核苷酸可以被突变。在一些实施方式中，该方法没有脱靶效应。在一些实施方式中，该方法产生真正完全被突变覆盖的基因元件。

18、本公开的方法有利地将改变的基因元件集合与提供易于检测的表型性状(诸如除草剂耐受性状(ht性状))的报告基因偶联。在一些实施方式中，使用ht性状作为报告基因允许仅通过根据预先确定的临界浓度施用/喷洒相关除草剂来进行真正大规模的自动植物内筛选。

19、在一些实施方式中，通过将ht性状或类似性状与感兴趣的改变的基因元件集合结合，可以将自动大规模筛选应用于任何感兴趣的性状相关基因。

20、例如，在一些实施方式中，ht性状或类似性状是有利的，其中对性状的评估需要评估对每个单个植物的影响，诸如影响植物产量的性状。

21、在一些实施方式中，报告基因是拟南芥的除草剂耐受性(ht)相关原卟啉原氧化酶(ppox1)基因(atppox1)，其导致表现出对ppo抑制剂(诸如，但不限于：恶草酮(oxadiazon)、丙炔氟草胺(flumioxazin)或唑酮草酯(carfentrazone ethyl))具有增强抗性的期望/有益的表型性状，从而允许对表现出与该性状功能偶联的任何期望作物植物的任何天然基因的改变的调控元件的期望表达变化的模型植物进行高通量筛选。

22、因此，本文公开的筛选提供了用于在植物内选择和识别具有优化活性的新型基因元件的方法，这有利于提供任何内源基因在植物内表达水平、活性和/或表达模式的期望改进。

23、有利地，本文公开的筛选利用报告基因(例如，ht基因)的表达来高通量筛选调控元件(调控元件优选源自作物植物，例如，干旱相关基因的启动子)以识别优化的调控元件。因此，可以通过监测报告基因表达和/或模型植物表型的变化(例如，增加的除草剂耐受性、荧光水平等)在模型植物中进行筛选，这是由于其与调控元件的特定改变版本功能偶联。

24、根据一些实施方式，所识别的基因元件经优化以表达与性状相关的基因，例如，提供除草剂耐受性(ht)的基因，其水平提供有利的性状增强，例如，作物植物对除草剂的抗性。

25、此外，本文公开了具有改善的天然除草剂耐受性(ht)的作物植物。基因编辑的植物包括通过该方法先前识别的调控元件的基因变化，以赋予增强的天然抗性。

26、根据一些实施方式，提供了用于在植物内高通量评价内源基因调控元件的方法，该方法包括以下步骤：获得编码性状相关基因的天然调控元件的核酸，将其与报告基因的编码序列偶联；并且其中，该调控元件是作物植物的调控元件；在该天然调控元件的多个拷贝中的每一个中引入一个或多个基因变化，从而获得包括大量改变的调控元件集合的基因文库；利用高通量转化将该基因文库引入至模型植物中，使得平均每个模型植物接收单个改变的调控元件；筛选转化的模型植物，其中，该筛选包括选择报告基因的表达水平/表型具有期望变化的模型植物；识别选定模型植物的改变的调控元件中的一个或多个基因变化。每种可能性均是单独的实施方式。

27、根据一些实施方式，该方法进一步包括基于选定模型植物的改变的调控元件中一个或多个识别的基因变化来修饰该作物植物的性状相关基因的天然调控元件。

28、根据一些实施方式，天然调控元件位于报告子的编码序列的上游、下游或内部或其任何组合。

29、根据一些实施方式，天然调控元件源自作物植物。

30、根据一些实施方式，报告基因编码序列与性状相关基因的调控元件具有相同或不同的基因。

31、根据一些实施方式，天然调控元件是启动子或其片段。

32、根据一些实施方式，该方法进一步包括应用算法来预测天然调控元件中的假定热点(hot-spot/hot spot)，并且其中，引入一个或多个基因变化包括将一个或多个基因变化靶向热点。

33、根据一些实施方式，基因变化包括针对调控元件的随机区域、预测的热点和/或其组合的改变。

34、根据一些实施方式，一个或多个基因变化选自一个或多个点突变、结构域交换、顺式元件重排、增强子添加和/或沉默子缺失。

35、根据一些实施方式，将基因文库引入至模型植物中包括克隆到农杆菌(agrobacterium)二元载体中。

36、根据一些实施方式，筛选报告基因的表达水平具有期望变化的模型植物包括满足预先确定的临界值。

37、根据一些实施方式，性状相关基因/报告基因的表达水平/表型的期望变化包括改变的调控元件的转录活性的变化。

38、根据一些实施方式，性状相关基因/报告基因的表达水平/表型的期望变化包括报告基因表达的时间、发育阶段、细胞定位、组织特异性和/或强度的一种或多种变化。

39、根据一些实施方式，性状相关基因/报告基因的表达水平的期望变化包括与基因功能和/或活性增加相关的表达增加。

40、根据一些实施方式，性状相关基因/报告基因的功能和/或活性增加赋予增强的植物抗性或提高的植物产量。

41、根据一些实施方式，增强的抗性包括对除草剂、昆虫、疾病、热、干旱、生物或非生物胁迫的耐受性。

42、根据一些实施方式，增强的抗性包括除草剂耐受性(ht)。

43、根据一些实施方式，除草剂耐受性(ht)包括增加天然酶的表达，该天然酶克服植物中除草剂的活性成分浓度，从而提高天然抗性。

44、根据一些实施方式，该天然酶是原卟啉原氧化酶(ppo1)、或对羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)、或5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)、或谷氨酰胺合酶，或乙酰乳酸合酶(als酶)、或7,8-二氢蝶酸合酶、乙酰-coa羧化酶(accase)或其任何组合。每种可能性均是单独的实施方式。

45、根据一些实施方式，使用基因编辑工具生成期望的作物植物。

46、根据一些实施方式，提供了基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其包括性状相关基因的修饰的调控元件，其中，该作物植物的性状相关基因的调控元件的修饰基于在选定模型植物的改变的调控元件中识别的一个或多个基因变化，该基因变化与报告基因表达水平的期望变化有关，如本文公开的方法所识别。

47、根据一些实施方式，提供了基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其包括包含性状相关基因的编码序列的修饰的基因元件，其中，包括作物植物的性状相关基因的编码序列的基因元件的修饰基于在包括选定模型植物的编码序列的改变的基因元件中识别的一个或多个基因变化，该基因变化与报告基因表达水平的期望变化相关，如本文公开的方法所识别。

48、根据一些实施方式，基因编辑导致天然酶的表达增加，从而增加植物对除草剂的天然抗性。

49、根据一些实施方式，该天然酶是原卟啉原氧化酶(ppo1)、或对羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)、或5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)、或谷氨酰胺合酶、或乙酰乳酸合酶(als酶)、或7,8-二氢蝶酸合酶、乙酰-coa羧化酶(accase)或其任何组合。每种可能性均是单独的实施方式。

50、根据一些方面，提供了构建体，其包括与除草剂耐受性(ht)基因偶联且功能相关的植物性状相关基因的基因修饰的启动子。

51、根据一些实施方式，基因修饰的启动子源自植物性状相关基因的内源启动子。

52、根据一些实施方式，基因修饰的启动子源自作物植物的内源启动子。

53、根据一些实施方式，除草剂耐受性(ht)基因对于作物植物是外源的。

54、根据一些方面，提供了基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其包括ppo1启动子，该ppo1启动子经基因修饰以在一个或多个位置包括一个或多个突变，该一个或多个位置对应于seq id no:2中所示的大豆启动子的-1229a、-1105t、-668a、-481t、-189a、-70t和-61t中的任何一个或多个位置。

55、在一些实施方式中，提供了基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其中，该作物植物是大豆。

56、在一些实施方式中，基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其中，该一个或多个突变包括置换、添加和/或缺失。

57、在一些实施方式中，基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其中，该一个或多个突变包括以下一个或多个：-1229a>c、-1105t>c、-668a del、-668a>g、-481t>g、-189ins a、-189a>c、-189a del、-70t>c和-61t>g。

58、在一些实施方式中，基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其中，该一个或多个突变包括至少两个突变位置。

59、在一些实施方式中，基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其中，ppo1启动子与seq id no:2具有至少90％序列同一性。

60、在一些实施方式中，基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其中，ppo1启动子包括seq id no:4-13中任一项所示的序列。

61、本发明的进一步实施方式、特征、优势和全部适用范围将根据下文给出的详细描述和附图而变得显而易见。然而，应当理解，虽然该详细描述指示了本发明的优选实施方式，但是其仅以示例的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。

技术特征：

1.一种用于在植物内高通量评价作物植物的内源基因调控元件的方法，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括基于所述选定模型植物的改变的调控元件中一个或多个识别的基因变化，修饰所述作物植物的性状相关基因的天然调控元件。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述天然调控元件位于报告子的编码序列的上游、下游或内部或其任何组合。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述报告基因编码序列与所述性状相关基因的调控元件具有相同或不同的来源。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述天然调控元件是启动子或其片段。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述基因变化包括针对所述调控元件的随机区域、预测的热点和/或其组合的改变。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个基因变化选自一个或多个点突变、结构域交换、顺式元件重排、增强子添加和/或沉默子缺失。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述将基因文库引入至模型植物中包括克隆到农杆菌二元载体中。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述筛选报告基因的表达水平具有期望变化的模型植物包括满足预先确定的临界值。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述性状相关基因/报告基因的表达水平/表型的期望变化包括所述改变的调控元件的转录活性的变化。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述性状相关基因/报告基因的表达水平/表型的期望变化包括表达的时间、发育阶段、细胞定位、组织特异性和/或强度的一种或多种变化。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述性状相关基因/报告基因的表达水平的期望变化包括与基因功能和/或活性增加相关的表达增加。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述性状相关基因/报告基因的功能和/或活性增加赋予增强的植物抗性或提高的植物产量。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述增强的抗性包括对除草剂、昆虫、疾病、热、冷、干旱、生物或非生物胁迫的耐受性。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述增强的抗性包括除草剂耐受性(ht)。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述除草剂耐受性(ht)包括增加天然酶的表达，所述天然酶克服所述植物中所述除草剂的活性成分浓度，从而提高天然抗性。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述天然酶是原卟啉原氧化酶(ppo1)、或对羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)、或5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(epsps)、或谷氨酰胺合酶、或乙酰乳酸合酶(als酶)、或7,8-二氢蝶酸合酶、或乙酰-coa羧化酶(accase)。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，所述期望的作物植物使用基因编辑工具生成。

19.一种基因编辑的作物植物或作物植物细胞，包括性状相关基因的基因编辑修饰的调控元件，其中，所述作物植物的性状相关基因的调控元件的修饰基于在选定模型植物的改变的调控元件中识别的一个或多个基因变化，所述基因变化与报告基因表达水平的期望变化有关，如权利要求1-18中任一项所述的方法所识别。

20.根据权利要求19所述的基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其中，所述基因编辑导致天然酶的表达增加，从而增加所述植物对除草剂的天然抗性。

21.一种基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其包括ppo1启动子，所述ppo1启动子经基因修饰以在一个或多个位置包括一个或多个突变，所述一个或多个位置对应于seq idno:2中所示的大豆启动子的-1229a、-1105t、-668a、-481t、-189a、-70t和-61t中的任何一个或多个位置。

22.根据权利要求21所述的基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其中，所述一个或多个突变包括置换、添加和/或缺失。

23.根据权利要求21或22所述的基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其中，所述一个或多个突变包括以下中的一个或多个：-1229a>c、-1105t>c、-668adel、-668a>g、-481t>g、-189ins a、-189a>c、-189adel、-70t>c和-61t>g。

24.根据权利要求21-23中任一项所述的基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其中，所述一个或多个突变包括至少两个突变位置。

25.根据权利要求21-24中任一项所述的基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其中，所述ppo1启动子包括与seq id no:2的至少90％序列同一性。

26.根据权利要求21-25中任一项所述的基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其中，所述ppo1启动子包括seq id no:4-13中任一项所示的序列。

27.根据权利要求19-20中任一项所述的基因编辑的作物植物或作物植物细胞，或权利要求21-26中任一项所述的基因编辑的作物植物或作物植物细胞，其中，所述作物植物是大豆。

技术总结
用于在植物内高通量评价作物植物的内源基因调控元件的方法，获得编码性状相关基因的天然调控元件的核酸，在该天然调控元件的多个拷贝中的每一个中引入一个或多个基因变化，利用高通量转化将基因文库引入至模型植物，筛选转化的模型植物，并识别选定模型植物的改变的调控元件中的一个或多个基因变化。

技术研发人员：德罗尔·沙利丁,诺姆·格林贝格,丹尼尔·贝沙尔,塔尔·科恩
受保护的技术使用者：植物ARC生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5