组合物、检测试剂、试剂盒、应用及检测方法

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及组合物、检测试剂、试剂盒、应用及检测方法。

背景技术：

1、抗生素具有抑菌或杀菌的作用，常应用于医疗、农业及畜牧业。然而，随着抗生素的广泛使用，抗生素的残留逐渐造成了环境的污染，对生态系统和人类健康造成了相当大的危害。因此，世界卫生组织提出“提高全球对抗生素耐药问题的认识”的要求，并鼓励公众、卫生工作者和政策制定者采用最佳做法，避免抗生素耐药的继续发生和扩大。除此之外，对生态系统中抗生素准确、可靠的检测也是必要的。传统的抗生素检测通常包括色谱/质谱法、微生物检测法、酶联免疫法。基于色谱/质谱的检测方法检测速度较快，但检测费用昂贵、操作较为复杂；微生物检测法虽然灵敏度较高，但其操作繁琐、测定时间较长；酶联免疫法虽然已经商业化，但仍存在检测时间长等问题。因此，建立一种快速、简便、准确的抗生素检测方法是非常重要的。

2、特异性检测是抗生素检测方法的必要条件，极大地影响了检测方法的可行性和实用性。抗生素的检测通常利用抗原-抗体相互作用或酶生物识别，但这些探针易受到外界环境的干扰从而影响其稳定性。适配体是一种新型的生物分子识别元件，其本质是人工筛选出的单链dna或rna。适配体通过疏水和静电相互作用、氢键和碱基堆叠等作用力与靶标结合，具有稳定、成本低、高特异性等优点。

3、crispr/cas系统作为一种新型的基因编辑工具，最初被发现于细菌和古细菌中，是一种对抗外来病毒入侵的免疫手段。crispr/cas系统因其易于操作、准确、可编程等优点，在分子诊断、遗传性疾病的基因诊断等领域具有广阔的应用前景。其中，cas12a因其靶向核酸的特异性和用户友好性而成为广泛使用的可编程生物传感器。cas12a通过crisprrna (crrna)的引导发挥作用，将其引导到特定的双链dna (dsdna)或单链dna (ssdna)序列。这种相互作用形成三元复合物并激活cas12a-crrna系统。随后，激活的cas12a不加选择地切割非特异性ssdna，使修饰在ssdna的两端额荧光团和猝灭剂分离，释放荧光信号。荧光信号的显著增加使目标的识别成为可能。除荧光信号输出外，cas12a-crrna系统还可用于其他的信号输出，如电化学、比色法或试纸条等。

4、目前已报道的cas12a-crrna系统一般以dsdna或ssdna为靶标，而很少用于非核酸靶标的检测。一般情况下，利用cas12a检测抗生素等非核酸类物质需要适配体作为识别待测物的组分，并通过链置换反应将非核酸类的靶标信号转换为核酸信号，然后利用cas12a-crrna系统进行检测。这些链置换反应的主要原理是设计一条与适配体序列互补的核酸链，该核酸链中存在激活cas12a-crrna系统的核酸序列。因此，当待测物存在时，适配体与待测物结合，与适配体互补的核酸链被暴露，从而激活cas12a-crrna系统。激活的cas12a能够对ssdna探针进行切割，通过电化学或荧光等方式进行信号的读取，从而实现对待测物的检测。然而这些方法都存在一定的局限性：1.一种crrna只能实现对一种待测物的识别，改变待测物需要重新设计crrna，使实验的周期及成本较高。2.方案中上游的链置换反应存在背景泄露的可能，需要不断优化反应条件。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了组合物、检测试剂、试剂盒、应用及检测方法。本发明克服了现有基于cas12a的抗生素检测技术的缺陷和不足，提供一种基于cas12a的高特异性、用户友好的抗生素检测方法。本发明建立的检测方法能够对不同环境中的抗生素进行灵敏的、特异性的识别，并且不需要昂贵的仪器设备，对加强监管抗生素的使用具有重要意义。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了组合物，包括：rna适配体、scaffold rna、cas12a蛋白、dna探针和cdna；

4、所述rna适配体的序列与所述cdna的序列部分或完全互补；

5、所述scaffold rna的序列具有：如seq id no:1所示的序列；

6、所述dna探针的序列具有：如seq id no:2所示的序列；

7、所述rna适配体特异性识别抗生素。

8、在本发明的一些实施方案中，上述组合物中，所述cas12a蛋白来源于new englandbiolabs m0653。

9、在本发明的一些实施方案中，上述组合物中，所述rna适配体具有如seq id no:3或seq id no:4所示的序列。

10、在本发明的一些实施方案中，上述组合物中，所述cdna的长度为17~27bp。

11、在本发明的一些实施方案中，上述组合物中，所述rna适配体、所述scaffold rna、所述cas12a蛋白、所述dna探针和所述cdna的摩尔比为：（0.5~5）:（0.25~2.5）:（0.25~0.5）:（0.1~0.5）:（0.1~1）。

12、在本发明的一些实施方案中，上述组合物中，所述rna适配体、所述scaffold rna、所述cas12a蛋白、所述dna探针和所述cdna的摩尔比为：1:1:0.5:0.5:1。

13、本发明还提供了检测试剂，包括：上述组合物。

14、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂，包括：检测试剂1和检测试剂2；

15、所述检测试剂1包括：5 μm的dna探针、0.25~2.5 μm的rna适配体和缓冲液；

16、所述检测试剂2包括：0.25~0.5 μm的cas12a、0.5~5 μm的scaffold rna、0.1~1 μm的cdna和缓冲液。

17、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂，包括：检测试剂1和检测试剂2；

18、所述检测试剂1包括：5 μm的dna探针、1 μm的rna适配体和缓冲液；

19、所述检测试剂2包括：0.5 μm的cas12a、1μm的scaffold rna、1 μm的cdna和缓冲液。

20、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述缓冲液包括：500 mm的nacl、100 mm的tris-hcl、100 mm的mgcl2和1000 μg/ml的重组白蛋白。

21、在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述缓冲液购买于：new englandbiolabs b6002。

22、本发明还提供了检测试剂盒，包括：上述组合物和/或上述检测试剂。

23、本发明还提供了上述组合物、上述检测试剂和/或上述检测试剂盒在检测抗生素中的应用。

24、在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述抗生素包括：妥布霉素和/或卡那霉素。

25、本发明还提供了抗生素的检测方法，将上述检测试剂中的所述检测试剂1与待测抗生素混合，孵育，再与所述检测试剂2混合，反应，根据荧光强度，检测所述抗生素的含量。

26、在本发明的一些实施方案中，上述检测方法，所述孵育的温度为25~37℃，时间为5~30 min。

27、在本发明的一些实施方案中，上述检测方法，所述孵育的温度为25℃，时间为30min。

28、本发明提供了组合物，包括：rna适配体、scaffold rna、cas12a蛋白、dna探针和cdna；

29、所述rna适配体的序列与所述cdna的序列部分或完全互补；

30、所述scaffold rna的序列具有：如seq id no:1所示的序列；

31、所述dna探针的序列具有：如seq id no:2所示的序列。

32、本发明提供的检测系统中可通过改变适配体及其互补的dna序列实现多种抗生素的检测，无需进行复杂的crrna筛选及优化，具有普适性；实现了直接用crispr/cas12a系统的抗生素检测，无需其他的信号转导方式，操作简单。

技术特征：

1.组合物，其特征在于，包括：rna适配体、scaffold rna、cas12a蛋白、dna探针和cdna；

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述cdna的长度为17~27bp。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述rna适配体、所述scaffold rna、所述cas12a蛋白、所述dna探针和所述cdna的摩尔比为：（0.5~5）:（0.25~2.5）:（0.25~0.5）:（0.1~0.5）:（0.1~1）。

4.检测试剂，其特征在于，包括：如权利要求1至3任一项所述的组合物。

5.如权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，包括：检测试剂1和检测试剂2；

6.如权利要求5所述的检测试剂，其特征在于，所述缓冲液包括：500 mm的nacl、100 mm的tris-hcl、100 mm的mgcl2和1000 μg/ml的重组白蛋白。

7.检测试剂盒，其特征在于，包括：如权利要求1至3任一项所述的组合物和/或如权利要求4至6任一项所述的检测试剂。

8.如权利要求1至3任一项所述的组合物、如权利要求4至6任一项所述的检测试剂和/或如权利要求7所述的检测试剂盒在检测抗生素中的应用。

9.抗生素的检测方法，其特征在于，将如权利要求6所述检测试剂中的所述检测试剂1与待测抗生素混合，孵育，再与所述检测试剂2混合，反应，根据荧光强度，检测所述抗生素的含量。

10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述孵育的温度为25~37℃，时间为5~30 min。

技术总结
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及组合物、检测试剂、试剂盒、应用及检测方法。本发明提供了组合物，包括：RNA适配体、scaffold RNA、Cas12a蛋白、DNA探针和cDNA；RNA适配体的序列与cDNA的序列部分或完全互补；scaffold RNA的序列具有如SEQ ID NO:1所示的序列；DNA探针的序列具有如SEQ ID NO:2所示的序列；RNA适配体特异性识别抗生素。本发明提供了一种组合物、检测试剂、试剂盒、应用及检测方法，能够对不同环境中的抗生素进行灵敏、特异性识别，且不需要昂贵的仪器设备，对加强监管抗生素的使用有重要意义。

技术研发人员：李冰凌,肖遥,唐艺丹,吕佰阳
受保护的技术使用者：中国科学院长春应用化学研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5