诺如病毒全基因组测序的引物组、试剂盒及方法与流程

本发明属于病毒基因测序，具体涉及一种基于扩增子技术的诺如病毒全基因组测序方法、测序使用的引物组和试剂盒。

背景技术：

1、诺如病毒（norovirus，nov）是一种带有包膜的单股正链rna病毒，属于人类杯状病毒科，是成年人腹泻的第一大病原和＜5岁婴幼儿腹泻的第二大病原。诺如病毒传播途径多种多样、感染剂量低、排毒时间长、环境抵抗力强、病毒变异快、免疫保护时间短，具有高度传染性和快速传播能力。全球范围内，诺如病毒是引起人急性胃肠炎疫情散发和暴发的主要病原体。

2、诺如病毒的流行不仅对人群健康造成严重威胁，也产生巨大的社会经济损失。在成功实施轮状病毒疫苗接种计划的高、中收入地区，诺如病毒同时也是儿童急性胃肠炎的最常见病因。全年龄阶段人群对诺如病毒皆易感，其中，诺如病毒发病率在＜5岁儿童最高，70%的0～4岁儿童诺如病毒病例发生在6～23月龄，低收入国家以及医疗机构场所诺如病毒感染患者年龄更小。目前，引起诺如病毒疫情的病毒株主要有gii.2[p16]、gii.3[p12]、gii.17[p17]、gii.6[p7]、gii.4[p31]。其中，近两年由诺如病毒单独感染的疫情中，gii.3[p12]占主导地位。

3、对病毒流行株进行基因检测和准确分型是实现精准治疗和有效控制疫情的有效手段，但是，本发明技术人员在长期工作过程中发现，常规的诺如病毒检测以及pubmed、知网等涉及诺如病毒全基因组分析的文章均是基于一代测序及宏基因组测序，目前ncbi收录的gii.3[p12]、全基因组序列仅有11条。本领域技术人员知晓，一代测序获得全基因组需开展10多个实验，复杂且耗时长，且因只获得一条序列，容易掩盖病毒突变等信息。不仅如此，基于粪便样本或肛拭子样本的宏基因组测序包含很多肠道微生物、人源性样本，获得的有效数据较少，需足够的测序深度，成本极高，且很难获得目的序列。目前，缺乏有效的针对诺如病毒的二代/三代全基因组测序方法，因此，开发一种简便和低成本的针对诺如病毒的二代/三代测序方法成为迫切需要攻克的技术问题。

4、扩增子测序是一种高靶向性方法，用于分析特定基因组区域中的基因变异。扩增子测序主要包括16s rdna测序、18s rdna测序、its测序及目标区域扩增子测序等。扩增子捕获测序作为全基因组测序的补充技术可大大简化实验流程和分析目标，是一个快速、有效的技术，在新一代高通量测序中发挥独特之处。

5、专利文献cn 117512213a公开一种诺如病毒gi-gix亚型全基因组捕捉试剂盒，所述试剂盒中包括3个引物池，引物池中的每一引物由靶向引物、umi序列和barcdoe序列排列组成，其优势在于可以有效降低后续建库过程中连接加barcdoe序列的成本，起到降低成本的作用。但是，所述技术方案用于检测诺如病毒gi-gix亚型，检测范围广，对诺如病毒流行株如gii.3[p12]的检测特异性不强。基于此，本发明提供一种专门针对诺如病毒流行株gii.3[p12]的全基因组测序方法，所述不仅能够反映诺如病毒主要流行株的突变特征，能够避免其它微生物对测序的干扰，保障更高的gii.3[p12]目的基因的测序深度，获得全基因组覆盖度更广，检测准确率高、特异性强。

技术实现思路

1、针对诺如病毒流行株gii.3[p12]的全基因组测序，本发明的一个目的是提供一组引物组，所述引物组对诺如病毒进行特异性多重pcr扩增，所述引物组扩增产生的扩增子以叠瓦式覆盖诺如病毒全基因组序列；本发明第二个目的是提供一种所述引物组在制备用于诺如病毒全基因组测序的产品中的应用；本发明的第三个目的是提供一种包括所述引物组的试剂盒；本发明还有一个目的是提供一种不以疾病诊断和治疗为目的的诺如病毒全基因组检测方法。

2、本发明包括如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一组引物组，其特征在于，所述引物组由表1中的引物对1至引物对22组成，所述引物组用于诺如病毒gii.3[p12]全基因组测序。

4、其中，引物对1由seq id no.1所示的正向扩增引物和seq id no.2所示的反向引物组成；引物对n由seq id no. (2n-1) 所示的正向扩增引物和seq id no.2n所示的反向引物组成，n选自2-22之间的整数。

5、在本发明的具体实施方式中，所述引物组分别在两个引物池中，其中，引物对1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21在引物池1中，引物对2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22在引物池2中。

6、第二方面，本发明提供一种本发明第一方面所述的引物组在制备用于诺如病毒gii.3[p12]全基因组测序的产品中的用途。

7、所述产品包括但不限于试剂、试剂盒、芯片、试纸、膜条或检测平台。

8、第三方面，本发明提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物组，或者所述试剂盒包括含有本发明第一方面所述的引物组的缓冲液。

9、进一步的，所述试剂盒还包括逆转录酶、pcr反应预混液、测序接头。

10、所述测序接头为本领域技术人员公知的适用于二代/三代测序平台的通用测序接头，所述测序平台包括但不限于illumina、ion或mgi，所述测序接头可通过市售试剂盒购买获得。

11、所述pcr反应预混液中包括无核酸酶水、缓冲液、dna聚合酶、mg2+，dntp，所述pcr反应预混液可通过市售途径购买得到。

12、第四方面，本发明提供一种不以疾病诊断和治疗为目的的诺如病毒gii.3[p12]全基因组测序方法，所述方法包括如下步骤：

13、（1）提取待检测样本核酸，逆转录获得cdna链；

14、（2）第一轮pcr扩增

15、以步骤（1）获得的cdna链为模版，利用本发明第一方面所述的引物组进行特异性pcr扩增，收集扩增产物；

16、（3）pcr扩增产物纯化和拼接；

17、（4）建立文库；

18、（5）上机测序；

19、（6）生信分析。

20、优选的，步骤（1）所述的待检测样本包括但不限于血液、咽拭子、唾液、感染组织。

21、在本发明的具体实施方式中，所述引物组分别在两个引物池中，其中，引物对1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21在引物池1中，引物对2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22在引物池2中。

22、优选的，所述引物池1和引物池2中的引物浓度为10-50µm。

23、更优选的，所述引物池1和引物池2中的引物浓度为10µm。

24、在本发明的具体实施方式中，pcr产物纯化后运用nextera® xt library prepkit进行建库，用miniseq进行测序，对下机序列以genbank accession number 为op901693序列为参考序列，使用clc genomicsworkbench 23.0 软件进行拼接。

25、本发明根据诺如病毒gii.3[p12]基因序列特征采用叠瓦式原理设计得到22对引物对，在实际应用中分为两个引物池进行特异性pcr扩增，从常规检测的10-15个反应体系兼容在2个反应体系中，有效缩短扩增时间和难度。

26、本发明提供的引物组能有效提高引物扩增子覆盖度，保证覆盖到病毒序列的1.5-1.8倍，相较于一代测序1-1.2倍覆盖度以及宏基因组测序无法有效获得全部的靶向序列，本发明更高保证了快速全覆盖的全基因组序列的获得。

27、本发明提供的高保真引物，保障序列突变的真实性，对病毒分型检测准确率高，有效提高gii.3p[12]在诺如病毒暴发疫情防控和流行趋势探索中的应用和推广。

技术特征：

1.引物组，其特征在于，所述引物组由引物对1至引物对22组成，所述引物组用于诺如病毒gii.3[p12]全基因组测序。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，引物对1由seq id no.1所示的正向扩增引物和seq id no.2所示的反向引物组成；引物对n由seq id no. (2n-1) 所示的正向扩增引物和seq id no.2n所示的反向引物组成，n选自2-22之间的整数。

3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组分别在两个引物池中，其中，引物对1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21在引物池1中，引物对2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22在引物池2中。

4.权利要求1-3任一所述的引物组在制备用于诺如病毒gii.3[p12]全基因组测序的产品中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述产品包括试剂、试剂盒、芯片、试纸、膜条或检测平台。

6.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一所述的引物组，或者所述试剂盒包括含有权利要求1-3任一所述的引物组的缓冲液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括逆转录酶、pcr反应预混液、测序接头。

8.不以疾病诊断和治疗为目的的诺如病毒gii.3[p12]全基因组测序方法，所述方法包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的待检测样本包括血液、咽拭子、唾液、感染组织。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，pcr产物纯化后运用nextera® xtlibrary prep kit进行建库，用miniseq进行测序，对下机序列以genbank accessionnumber 为op901693序列为参考序列，使用clc genomics workbench 23.0 软件进行拼接。

技术总结
本发明公开一种诺如病毒全基因组测序的引物组、试剂盒及方法，属于病毒基因测序技术领域。本发明根据诺如病毒GII.3[P12]基因序列特征采用叠瓦式原理设计得到22对引物对，在两个引物池进行特异性PCR扩增，缩短扩增时间和难度，提高引物扩增子覆盖度和全基因组捕获效率，对GII.3[P12]诺如病毒疫情溯源和传播趋势鉴定准确率高，有利于提高GII.3P[12]在诺如病毒暴发疫情防控和流行趋势探索中的应用和推广。

技术研发人员：高志勇,沈玲羽,李伟红,田祎,刘白薇,冯兆民,张代涛,杨鹏,王全意
受保护的技术使用者：北京市疾病预防控制中心
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5